摘要：目的構(gòu)建含有人叉頭框蛋白O1(FoxO1)結(jié)合靶位點(diǎn)(即胰島素反應(yīng)元件,IRE)的以螢火蟲熒光素酶(Luc2)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為雙報(bào)告基因的FoxO1抑制劑高通量篩選細(xì)胞模型,進(jìn)行FoxO1抑制劑的篩選,并對獲得的陽性化合物細(xì)胞活性進(jìn)行初步研究,以期獲得能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病的先導(dǎo)化合物或候選藥物。方法用分子生物學(xué)的方法,構(gòu)建含有胰島素反應(yīng)元件的并連接Luc2和EGFP雙報(bào)告基因的重組載體pc-IRE-LE。將體外培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞用該重組載體進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,分別利用螢火蟲熒光素酶試劑盒和熒光顯微鏡對熒光素酶活性及綠色熒光蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測,從而構(gòu)建細(xì)胞模型并對其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和評價。應(yīng)用該細(xì)胞模型對化合物庫進(jìn)行高通量篩選,隨后利用實(shí)時定量RT-PCR的方法對篩選獲得的陽性化合物的FoxO1抑制劑活性,即對FoxO1多個糖脂代謝相關(guān)靶基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果成功構(gòu)建了具有Luc2和EGFP雙報(bào)告基因的FoxO1抑制劑高通量篩選細(xì)胞模型,并完成了模型評價。經(jīng)過對6000余個化合物的篩選,共獲得6個具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系的陽性化合物。其中化合物7625-H9在模型上表現(xiàn)出良好的FoxO1抑制劑活性,并在細(xì)胞上對FoxO1多個靶基因PEPCK、G6Pase、apoC-Ⅲ和MTP的mRNA水平均有顯著的抑制作用。結(jié)論該模型符合高通量篩選的要求,可用于FoxO1抑制劑的高通量篩選。該模型的應(yīng)用將為新型調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂藥物的發(fā)現(xiàn)提供一個可靠而有效的方法。