av激情网-国产精品免费视频观看-红色一级毛片-久久综合网丁香五月-欧美亚洲一区二区在线观看-色情无码一区二区三区

學術刊物 生活雜志 SCI期刊 投稿指導 期刊服務 文秘服務 出版社 登錄/注冊 購物車(0)

首頁 > 精品范文 > 干細胞培養技術

干細胞培養技術精品(七篇)

時間:2023-06-30 15:46:05

序論:寫作是一種深度的自我表達。它要求我們深入探索自己的思想和情感,挖掘那些隱藏在內心深處的真相,好投稿為您帶來了七篇干細胞培養技術范文,愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑,助力您的創作。

干細胞培養技術

篇(1)

達情況,著重觀察單個細胞培養形成細胞克隆的形態與時間。結果 以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單個細胞,在96孔板中進行體外培養,獲取12個細胞亞系(獲取比例為6.25%),均有高成瘤性。癌干細胞相關標志CD44

與ESA均為高水平表達,而CD184表達則在12個細胞系之間有差異。在單個細胞培養中,形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態,12個細胞亞系均源于單個細胞形成的完全克隆,均可進行連續傳代與擴增,而部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡。結論 Tca8113M1細胞系中可能存在癌干細胞,而單細胞培養可形成完全克隆并建立細胞亞系,是進行舌癌干細胞后續研究重要的細胞培養模式。

[關鍵詞] 單細胞; 有限稀釋法; 舌癌干細胞; 完全克隆

[中圖分類號] Q 21 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細胞是癌組織中一小群具有干細胞特性的細胞,具有自我復制與更新的能力,而且增殖與分裂能力極強,少量細胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關腫瘤發生、轉移、耐藥與復發等諸多難題均從癌干細胞的角度進行研究。這種研究的基礎和前提是明確癌干細胞的標志或分離出癌干細胞,以提供研究的靶細胞。目前已發現多種永生性癌細胞系中存在有癌干細胞,Tca8113M1舌癌細胞系同樣可能存在有癌干細胞,可以作為舌癌干細胞的研究對象。鑒于癌干細胞獨特的自我復制與更新能力,本研究以Tca8113M1舌癌細胞系為研究對象,采用有限稀釋法分離出單個舌癌細胞進行體外培養,利用癌干細胞的自我復制能力進行分裂增殖,形成預期的單細胞克隆,進一步形成細胞亞系,以此證明Tca8113M1

舌癌細胞系中存在癌干細胞的可能性,同時檢測細胞亞系癌干細胞標志的表達情況,觀察不同細胞亞系的生物學特性,并且動態觀察單細胞培養中細胞克隆形成的規律,為從Tca8113M1細胞系中分離舌癌干細胞提供前期實驗依據。

1 材料和方法

1.1 舌癌細胞系來源

人舌癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系,四川大學華西口腔醫院贈送。右江民族醫學院腫瘤分子生物學實驗室在此基礎上建立了轉移人舌癌細胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清(Hyclone公司,美國),RPMI1640培

養基(Gibco公司,美國);PE標記抗人CD44抗體,異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的抗人細胞外可溶性抗原(extracellular soluble anti-

gen,ESA)抗體,PE/cy5標記抗人CD184抗體,同

型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養箱(日本三洋公司),流式細胞儀(BD公司,美國),倒置顯微鏡(Olympus公司,日

本)。

1.3 體外單細胞培養、建系及細胞克隆生長的動態

觀察

采用有限稀釋法進行體外單細胞培養與建系。Tca8113M1細胞經復蘇后,使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液,轉移至96孔板,采用有限稀釋法保證每個孔有1個細胞,在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況,待其生長成多個細胞克隆后,用0.25%胰蛋白酶消化轉移至6孔板擴增培養后,在培養瓶中反復傳代建立細胞亞系。此外,在此培養過程中動態觀察單個細胞形成細胞克隆的形態與生長情況,觀察時點分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細胞亞系成瘤性檢測

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細胞亞系細胞,選取形態良好的生長期細胞,在生長旺盛時接種。具體步驟如下:消化收集舌癌細胞,800 r?min-1離心3~

5 min,棄上清液,計數細胞總量,以含10%胎牛血清的DMEM培養液按每毫升1×107個細胞的密度稀釋細胞;消毒裸鼠右腋窩的皮膚,將細胞接種于皮下,以皮下結節直徑超過1.0 cm為成瘤標準。共接種裸鼠45只,具體分組如下:1)Tca8113M1舌癌細胞亞系組,共12個亞系,每組3只,共36只;2)Tca8113M1舌癌細胞組,6只,為母系細胞系對照組;3)Tca8113舌癌細胞組,3只,為來源細胞系對照組。

1.5 流式細胞術檢測舌癌細胞亞系癌干細胞相關標

志CD44、CD184、ESA的表達情況

將舌癌細胞(密度為每毫升1×106個)消化以后,800 r?min-1離心5 min,棄上清液,加入D-hanks液重懸,盡量將細胞吹散,將細胞懸液分別移入試管中(每管體積為500 μL),設置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體(分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4)各5 μL,在樣本管中加入熒光抗體(PE標記抗人CD44、FITC標記抗人ESA、PE/cy5

標記抗人CD184)各5 μL,置于避光環境下室溫孵育30 min,然后于流式細胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達情況。

2 結果

2.1 Tca8113M1細胞體外單細胞建系培養

Tca8113M1單細胞培養12 h后,細胞貼壁;24 h后部分細胞出現變大變薄、空泡樣變等老化現象;3 d后,有7個孔的細胞出現增殖分裂現象;7~10 d后有12個孔的細胞開始增殖為單個或數個完全細胞克隆(克隆形成過程見圖l)。

培養4~6周后,細胞基本達到穩定生長并增殖的狀態,以癌細胞的克隆樣生長為主,細胞呈鋪路石狀,可見巨核、多核細胞,核分裂象多見。待培養孔接近80%鋪滿時,將細胞轉移至6孔板上擴增培養,1~2周后轉移至培養瓶中繼續傳代培養,穩定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細胞,并在96孔板中進行體外傳代建系培養,獲取12個細胞亞系,比例為6.25%,分別命名為Tca8113-S1~Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細胞體外單細胞培養形成細胞克隆

的動態觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時點,發現單個細胞形成細胞克隆的形態主要有3種:完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1~Tca8113-S12細胞亞系的細胞均源于單個細胞形成的完全克隆,均可以進行連續傳代與細胞培養擴增,而其他單個細胞培養形成的部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡,未能連續傳代進行細胞擴增。3種克隆在培養過程中的變化情況如下。1)完全克隆:細胞之間緊湊密集成型,增殖速度快,其中1~2周為典型的完全克隆狀,3周時在細胞克隆中央出現細胞重疊生長現象(圖2中A1~A4);2)部分克隆:克隆形態界于旁克隆與完全克隆之間,細胞間較疏松,其中1~2周為典型的部分克隆狀,但第3周細胞克隆疏松,形狀消散,

有轉變為旁克隆的趨勢(圖2中B1~B4);3)旁克隆:

細胞間疏松不成型,第1周較典型,第2、3周后細胞老化(圖2中C1~C4)。

2.3 Tca8113M1舌癌細胞亞系成瘤情況

將舌癌細胞亞系Tca8113-S1~Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后,1周后可觸及皮下結節,表面光滑、質硬、可活動;2周后可見皮下結節生長迅速;3~4周后皮下結節最大直徑達1.0 cm以上。含對照組在內的45只裸鼠均接種成瘤,成瘤率為100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞亞系癌干細胞相關標志

CD44、CD184、ESA表達情況

流式細胞術檢測結果見表1:除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外,其余細胞亞系ESA的陽性表達率均在80%以上;各亞系CD44陽性表達率均很高,除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外,其余亞系的陽性率均在90%以上;12個亞系的CD184表達存在差異,陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經典的細胞培養技術,以舌癌Tca8113M1細胞系為研究對象,隨機選取192個舌癌細胞,在96孔板中進行單細胞培養,經過長期傳代培養,共建立12個舌癌Tca8113細胞亞系,比例為6.25%,而且都具備很強的成瘤性。進一步檢測12個Tca8113細胞亞系的癌干細胞相關標志,結果發現:CD44與ESA均為高水平表達,陽性表達率多在90%左右,而CD184的陽性表達率則各有不同。據此結果可以結合癌干細胞的生物學特性對本實驗獲得的細胞系進行分析。

本研究發現:舌癌Tca8113M1細胞系中有6.25%的單個細胞可以進行自我分裂、增殖,形成細胞亞系。還有研究[3]發現:Tca8113細胞連續經過兩次單細胞培養實驗,其中具備分裂增殖活性的細胞比例為5.09%~10.85%。這提示即使在永生化細胞系中,具備持續增殖能力的細胞占整個群體的比例都較少。根據目前的文獻[4]報道,在癌細胞群或組織中,癌干

細胞比例為0.01%~5%;體外培養的永生化癌干細胞系中,癌干細胞的比例可能偏高一些。本研究采用經典的有限稀釋法獲取單個細胞,這種細胞表現出強大的增殖與分裂活力,而且還形成了成瘤性很強的細胞亞系。這些單個培養的細胞是否就是癌干細胞尚需進行單細胞水平的鑒定,但可以大膽推測的是,其中應該包含有癌干細胞。腫瘤干細胞的概念于20世紀60年代提出,并據此建立了腫瘤細胞克隆實驗。本研究在單個細胞培養中也發現,單細胞的增殖方式是克隆樣增殖,即形成一個細胞克隆后擴大生長,并且在周圍形成小的細胞克隆,最后融合成片,但究其細胞來源就是一個癌細胞而已,所有后續的細胞克隆與癌細胞就是源于它,所以可以認為該細胞具有癌干細胞的潛質,可以考慮從癌細胞系中篩選癌干細胞。

在12個Tca8113細胞亞系中,為明確其癌干細胞相關標志的表達情況,為后續舌癌干細胞的篩選提供前期實驗數據,本研究綜合文獻報道,選取了CD44、ESA與CD184等癌干細胞相關標志進行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌等上皮組織的癌干細胞的相關標志,CD184是胰腺癌干細胞的相關標志;ESA則是上皮來源的癌干細胞標志,而且屬于細胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細胞亞系中,

CD44與ESA均處于高水平表達,而CD184的表達則高低不一,其中亞系間均數差值最大者接近60%。從這3個指標的表達情況來分析,可以進行如下推測:1)CD44與ESA是不同細胞亞系共有的標志,提示這些細胞亞系可能具有共同的組織起源;2)CD184的差異性表達提示Tca8113細胞系中存在細胞異質性,但從其比例來看,大致有3個等級,即15%、30%、50%以上,提示其生物學特性可能有明顯的差別,但可作為舌癌干細胞研究的候選細胞群體進行研究。

此外,在單個細胞培養基礎上建立細胞亞系的過程中,筆者發現單個細胞形成細胞克隆的形態與細胞最后成系關系密切。在單個細胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中,只有完全克隆能夠形成細胞亞系,而且這些細胞亞系表現出腫瘤的異質性與成瘤性,而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴增培養過程中逐漸老化或消亡。這一結果可進行逆向推理:將最初形成完全克隆的12個細胞確定為舌癌干細胞,而其形成的完全克隆則是癌干細胞自我更新與增殖的結果,其中可能富含癌干細胞。這一觀點也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經膠質瘤等相關研究[7-12]所證實。這些研究發現完全克隆細胞可以高表達癌干細胞標志;接種1 000個完全克隆前列腺癌細胞就可形成移植瘤;通過懸浮球培養的癌細胞球在消化后進行單細胞培養,可以形成高比例的完全克隆。有學者[13]進一步在頭頸腫瘤細胞系中發現,CD133與CD44陽性表達的癌細胞多形成完全克隆,而CD133與CD44陰性的癌細胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆,從而認為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細胞的標志。由此可見,完全克隆為癌干細胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細胞及癌干細胞標志的研究提供了新的途徑,近年在癌干細胞研究中逐漸被應用和關注[11]。此外,針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中,典型的完全克隆在單個細胞培養1~2周時形成,最好不要超過3周;擴增培養后,可使癌干細胞比例減少或分化細胞比例增加,從而影響對癌干細胞行為學的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細胞的前期性和階段性實驗,但是結果很有意義,這12個細胞亞系表明了Tca8113M1細胞系中有存在舌癌干細胞的可能性,而其最初的來源細胞系Tca8113也應存在癌干細胞。結合細胞克隆形態分析的單個癌細胞培養模式可為深入研究舌癌干細胞提供細胞研究平臺。

[參考文獻]

[1] Tan BT, Park CY, Ailles LE, et al. The cancer stem cell hypo-

thesis: A work in progress[J]. Lab Invest, 2006, 86(12):1203-

1207.

[2] 姚金光, 鄺曉聰, 溫冠媚, 等. 舌鱗狀細胞癌淋巴道轉移裸鼠模

型建立的實驗研究[J]. 右江醫學, 2006, 34(6):581-583.

Yao Jinguang, Kuang Xiaocong, Wen Guanmei, et al. Establish-

ment of the tongue squamous cell carcinoma lymphatic metastasis

model of the nude mouse[J]. Youjiang Medical J, 2006, 34(6):

581-583.

[3] 王開, 康非吾, 閔睿, 等. Tca8113細胞系單細胞體外增殖的實

驗觀察[J]. 口腔頜面外科雜志, 2008, 18(6):398-401.

Wang Kai, Kang Feiwu, Min Rui, et al. Proliferation potentials of

Tca8113 cell line in human tongue squamous carcinoma[J]. J Oral

Maxillofac Surg, 2008, 18(6):398-401.

[4] Jordan CT, Guzman ML, Noble M. Cancer stem cells[J]. N Engl

J Med, 2006, 355(12):1253-1261.

[5] Woodward WA, Sulman EP. Cancer stem cells: Markers or bio-

markers[J]. Cancer Metastasis Rev, 2008, 27(3):459-470.

[6] Hermann PC, Huber SL, Herrler T, et al. Distinct populations of

cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity

in human pancreatic cancer[J]. Cell Stem Cell, 2007, 1(3):313-

323.

[7] Locke M, Heywood M, Fawell S, et al. Retention of intrinsic stem

cell hierarchies in carcinoma-derived cell lines[J]. Cancer Res,

2005, 65(19):8944-8950.

[8] Biddle A, Liang X, Gammon L, et al. Cancer stem cells in squa-

mous cell carcinoma switch between two distinct phenotypes that

are preferentially migratory or proliferative[J]. Cancer Res, 2011,

71(15):5317-5326.

[9] Miloszewska J, Gos M, Przybyszewska M, et al. Mouse sarcoma

L1 cell line holoclones have a stemness signature[J]. Cell Prolif,

2010, 43(3):229-234.

[10] Pfeiffer MJ, Schalken JA. Stem cell characteristics in prostate can-

cer cell lines[J]. Eur Urol, 2010, 57(2):246-254.

[11] Zhou ZH, Ping YF, Yu SC, et al. A novel approach to the iden-

tification and enrichment of cancer stem cells from a cultured hu-

man glioma cell line[J]. Cancer Lett, 2009, 281(1):92-99.

[12] Li H, Chen X, Calhoun-Davis T, et al. PC3 human prostate car-

cinoma cell holoclones contain self-renewing tumor-initiating cells

[J]. Cancer Res, 2008, 68(6):1820-1825.

[13] Zhang S, Balch C, Chan MW, et al. Identification and charac-

篇(2)

關鍵詞: 植物 干細胞 教學應用

干細胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一類細胞,目前學習者對動物干細胞的理論和應用知識掌握較多。由于植物細胞的全能型,長期以來很多學習者誤認為植物中不存在干細胞,再加上教師對干細胞這部分內容的講授不透徹,造成學習者對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念往往混淆不清,存在植物干細胞認知上的錯誤,因此很有必要對植物干細胞的相關知識進行總結。

1.植物干細胞

1.1植物干細胞的概念和特征。植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞,具有自我更新和再生能力。植物干細胞具有很強的自我更新能力,并且可以分化為特化的細胞類型,這些特化的細胞產生新的植物器官(根、莖、葉和花等)。這些細胞表型的變化是由影響植物功能的基因表達變化引起的,受到內源性和外源性的信號共同調節[1]。植物干細胞的特征包括:能夠形成所有分化細胞的類型;具有自我更新的能力,維持干細胞的數量;位于分生組織。

1.2植物干細胞與動物干細胞的比較。在動物中,通常將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有全能性,它可以分化形成所有的成體組織細胞,甚至發育成為完整的個體;成體干細胞(如造血干細胞、神經干細胞、間充質干細胞、皮膚干細胞等)大多為多能干細胞,它們具有多向分化的潛能,可以分化形成除自身組織細胞外的其他組織細胞,真正具有全能性的細胞是受精卵和其分裂產生的子細胞。與此相比,許多植物干細胞具有旺盛的再生能力,在干細胞的整個生活周期中能使植物生長并且產生新的器官(如植物莖端分生組織中的干細胞和根端分生組織中的干細胞)[2]。

1.3植物干細胞與植物愈傷組織細胞的比較。植物愈傷組織細胞是由成體細胞經過脫分化而形成的具有分化能力的細胞,雖然愈傷組織的分化能力與植物干細胞相似,但它們在來源、細胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈傷組織細胞來源于異質性的體細胞,它是體細胞對損傷的暫時響應,是一個臨時獲得刺激的細胞,盡管愈傷組織具有干細胞樣屬性,但愈傷組織不易維持穩定的細胞分裂[3]。而植物干細胞來源于植物分生組織的同質性細胞,它們在植物的整個生命周期可以產生并形成新的組織和器官。

2.植物干細胞的類別與調控

根據分生組織的種類,植物干細胞可分為莖尖分生組織中的干細胞和根尖分生組織中的干細胞。

2.1莖尖分生組織中的干細胞。莖尖分生組織包括中心區和中心區下方的帶狀區。中心區包括上部干細胞區和下部的組織中心(即干細胞區下部靠近帶狀區的小細胞群)。干細胞分裂時上部的干細胞分裂成兩部分子細胞,一部分干細胞后裔留在中心區并保持多能性;另一部分細胞則離開莖尖分生組織的中心區,但保持較快的分裂速度,最終分化為葉或者花原基器官,為側生器官的生長和分化提供保證[4]。目前已知的位于干細胞周圍“組織中心”的WUS(WUSCHEL)是保持莖尖干細胞特征的必要信號分子,它參與對莖尖干細胞的穩態調控,使整個植物莖尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化。

2.2根尖分生組織中的干細胞。靜止中心位于根尖分生組織中心,干細胞則圍繞在靜止中心細胞周圍。靜止中心作為組織中心維持周圍干細胞的穩定和功能,靜止中心周圍的干細胞分布于中柱鞘外側,維管干細胞形成維管組織、皮層/內皮層干細胞,進而形成皮層、內皮層與根冠干細胞,然后形成根冠細胞。目前已知的WOX5(WUS-RELATED HOMEOBOX 5)作為最主要的干細胞決定因子,特異的表達于根端分生組織的靜止中心,參與對根端干細胞的穩態調控,使整個植物的根尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化[4]。

3.植物干細胞的應用

3.1生產天然產物,開發藥品或者化妝品。傳統的植物細胞培養存在細胞生長緩慢、生產成本高等問題,而植物干細胞培養具有遺傳穩定、細胞生長率和生長模式穩定、凝集程度低等優點,可以用來大量生產有用的植物天然產物,并用于藥品、功能性食品、化妝品中。如懸浮培養紫杉干細胞可以生產松香烷型三環二萜、美麗紅豆杉素A和美麗紅豆杉素B等產物,以達到抑制腫瘤血管的生成和抗癌作用,而且其產值遠大于傳統細胞培養的產值,具有很好的開發前景[5]。

3.2植物細胞系庫的建立和利用。一般的植物細胞凍存后存活率低,恢復生長能力慢,因此限制其在植物細胞培養中的應用。植物干細胞系在低溫儲藏方面有很大的優勢,不僅有高的存活率,而且在低溫儲藏前后遺傳物質沒有變異,是植物細胞系庫建立的很好材料。細胞系庫的建立不僅會使研究材料的供應得到滿足,而且使植物細胞系的研究周期縮短,并在植物種子資源的保存和利用方面發揮重要作用[6]。除了以上應用外,利用植物干細胞還可以進行植物干細胞的分子調控機制和分子設計育種等方面的研究。

4.結語

植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞,它們具有自我更新和再生能力。根據目前學習者對植物干細胞認識不足的實際,本文對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念進行了辨析,并對植物干細胞的分類及應用進行了論述。學習者清楚植物干細胞、植物愈傷組織細胞和動物干細胞的概念后,在學習植物干細胞的理論和應用等方面時才能正確理解相關的知識點。

參考文獻:

[1]于榮敏,周良彬.食品與藥品[J].2012,14(01):52-55.

[2]李寶鈞.哺乳動物干細胞的研究進展[J].畜牧業,2008,234(10):24-27.

[3]游云,蔣超,黃璐琦.試析植物干細胞與動物干細胞的異同[J].中國中藥雜志.2014,39(2):343-345.

[4]田奇琳,賴鐘雄.植物干細胞研究進展[J].園藝與種苗,2013(8):56-62.

篇(3)

放免法檢測胰島素分泌量。結果: 在大鼠β細胞素濃度為20~30 mg/L時, 大鼠胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團的數量明顯高于對照組; 其胰島素分泌量明顯高于對照組(P

【關鍵詞】 β細胞素; 糖尿病 胰腺干細胞

胰島移植是治療糖尿病的一個熱點, 但供體的缺乏和存在免疫排斥反應限制了其應用。胰腺干細胞能定向分化成胰島細胞, 這為胰島移植提供了新的材料來源[1]。細胞生長因子在干細胞的發育和分化中發揮了重要作用。研究表明, β細胞素(betacellulin, BTC)屬于表皮細

胞生長因子家族中的一個成員, 具有多種生物學功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表達, 提示BTC可能在胰腺組織的發育中發揮重要的生理作用[2, 3]。本研究中通過建立穩定的胰腺干細胞體外培養方法, 將β細胞素用于胰腺干細胞的體外培養, 觀察其是否能促進胰腺干細胞轉分化為成熟的胰島, 為克服胰島移植時的供體短缺提供新的胰島來源。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠(體質量250 g, 雌雄不限, 飼養于清潔級動物房自由飲水和進食, 手術前1 d禁飲食)由第四軍醫大學動物中心提供, Ⅴ型膠原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 堿性成纖維細胞生長因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)購自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 購自杭州四季青生物制品公司; 雙硫腙(dithizone, DTZ)、 二甲基亞砜(DMSO)、 煙堿購

于華美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗體購自北京中山生物工程有限公司; 免疫組化SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 購于Gibco公司; 胰島素放射免疫分析試劑盒購于北京北方生物技術研究所; 大鼠β細胞素由本研究室采用基因工程方法獲得[4]。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胰腺干細胞的分離、 培養

采用宋振順等[5]的方法, 首先以Ⅴ型膠原酶消化成年SD大鼠胰腺組織, 然后采用非連續密度梯度離

心法純化消化后的胰腺細胞, 去除胰島細胞后, 收集外分泌部細胞進行培養。所獲的細胞培養在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培養液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L鏈霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天將培養液改為DMEM/F12, 其中加入ITS(5 mU/L胰島素+5 mg/L轉鐵蛋白+5 mg/L硒)500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L煙堿, 0.01 ng/L KGF等。此后每2~3 d換液1次。于相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況和克隆形成情況。

1.2.2 胰腺干細胞免疫組織化學染色

分別取培養3、 7、 14 d后的細胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS緩沖液沖洗玻片, 分別與兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗體4℃反應過夜, 二抗及呈色反應參照SP試劑盒說明。二氨基聯苯胺(DAB)顯色, 顯微鏡觀察, 自來水沖洗, 蘇木精復染, 中性樹膠封固。陰性對照用PBS代替一抗。

1.2.3 雙硫腙染色與計數

雙硫腙(DTZ)為螯合劑, 可與鉛、 銅、 鋅等螯合, 人和動物(豚鼠除外)的胰島β細胞因含有鋅, 雙硫腙染色呈猩紅色, 其他胰島細胞不著色。配制及染色方法: 用二甲基亞砜(DMSO)配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks(pH7.8)1∶100稀釋, 0.22 μm濾膜過濾, DTZ與胰腺干細胞培養后轉分化形成的克隆混合, 室溫5~10 min后做鏡檢。按胰島的直徑>50 μm計數染色的胰島樣細胞團,

1.2.4 胰島素檢測

胰腺干細胞轉分化后形成的胰島克隆對葡萄糖刺激有胰島素分泌反應。顯微鏡下挑取100個胰島樣細胞團克隆, 培養于24孔培養板, 先用含低糖(5.5 mmol/L)的DMEM/F12培養液在37℃下孵育1 h后, 更換為含高糖(16.7 mmol/L)加煙堿(10 mmol/L)的DMEM/F12培養液在37℃下孵育2 h后, 取培養液上清, 采用放免法測定胰島素含量。

1.2.5 實驗分組

按照實驗方法1.2.1中胰腺干細胞的培養方法培養大鼠胰腺干細胞, 并將其設為正常對照組, 各實驗組中分別加入不同濃度的大鼠β細胞素, 依次為10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共設立5個實驗組。

1.2.6 統計學處理

采用Student t檢驗方法, 應用SPSS10.0統計軟件完成統計學分析。

2 結果

2.1 成人胰腺導管上皮細胞光鏡下形態學變化

收獲的非胰島細胞于24~48 h內部分黏著于培養瓶底。在第1~3天換液時, 大量漂浮于培養液中的外分泌細胞和胰島被棄除。培養5 d內, 單個貼壁細胞迅速擴增為鵝卵石樣小細胞片進而分裂增殖成單層細胞。培養第3天改用無血清培養液及加入霍亂毒素, 可明顯地促進導管上皮細胞的生長和抑制成纖維細胞的污染。細胞培養第7天胰島樣細胞芽團開始從細胞片或單層細胞的中央或邊緣出現, 同時鵝卵石樣細胞片迅速擴大。此后大量胰島樣細胞芽團和囊狀細胞團出現。雙硫腙染色呈弱陽性。第21~27天, 大量較成熟的胰島樣結構出現,雙硫腙染色強陽性(圖1)。

2.2 免疫組織化學

(1)CK19染色: 細胞培養第1天, 4孔板中的部分細胞呈CK19抗體染色強陽性。此時的細胞多為貼壁的單個或小細胞片, 亦可見較多陰性反應的細胞碎片。培養3 d后, 細胞片不斷擴大, 第7天起, 可見胰島樣細胞芽團出現并逐漸增多, 絕大多數細胞集落和胰島樣細胞芽團均為CK19強陽性(圖2)。(2)PDX1染色: 培養第1天, 4孔玻板中的細胞大部呈PDX1抗體染色陽性。但在同一細胞片中細胞染色程度不一, 部分呈強陽性, 部分呈弱陽性, 少數細胞為陰性。第7天起, 可見胰島樣細胞芽團逐漸增多; 第11~27天, 胰島樣細胞芽團不斷增大, PDX1抗體染色呈強陽性(圖3)。

2.3 BTC對胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團的影響

在正常對照組中, 胰島克隆為(139±8.5)個/g胰腺, 各實驗組培養液中加入不同濃度的大鼠β細胞素后, 胰島克隆的數量明顯增加, 在大鼠β細胞素的濃度為20~30 mg/L時, 培養液中胰島樣細胞團克隆的數量增加最為明顯

(P

2.4 胰島素分泌量的檢測

各實驗組分別挑取100個胰島樣細胞團(直徑>50 μm), 培養于24孔培養板中, 胰島素分泌試驗結果表明, 在正常對照組中, 培養液上清中胰島素含量為(3.0±0.4)μU/100胰島。各實驗組培養液中加入不同濃度的大鼠β細胞素后, 培養液中胰島素的分泌量也有明顯增加, 在大鼠β細胞素的濃度為20~30 mg/L時, 培養液中胰島素的分泌量增加最為明顯(P

3 討論

由于胰島素產生細胞的缺陷或缺乏導致的Ⅰ型糖尿病不僅對患者及其親屬, 而且對社會均帶來了嚴重的負擔。開發胰島素產生細胞新的來源諸如豬的胰腺、 人體胰腺導管上皮細胞、 胎兒胰腺干細胞和胚胎干細胞成為目前研究的熱點。其中最有前景的是由人胰腺導管上皮細胞轉

分化為胰島β細胞。

本實驗觀察到胰腺導管上皮細胞在培養第1天, 絕大多數貼壁生長的細胞為單個細胞或很小的細胞團。這些單個細胞和小細胞片在7 d 內迅速生長擴增為鵝卵石樣細胞片和大面積單層細胞片。胰島樣細胞芽團于培養第7天出現, 部分細胞PDX1 的表達及CK19 染色陽性從培養

第1天即開始。PDX1基因是一種在胰島細胞發育、成熟過程中有高表達的基因, 而CK19是胰腺導管上皮細胞向干細胞轉化的標志, 部分細胞PDX1的表達及CK19 染色陽性說明培養的細胞自第一天起即開始轉分化,這與Gmyr等[6]所報告的結果相似。

近年的研究表明, 一種肽類表皮細胞生長因子β細胞素(BTC)在活體動物體內能有效的促進糖尿病鼠及90%胰腺切除鼠胰島細胞的再生和成熟[7], 將大鼠胰腺切除90%后, 立即給大鼠尾靜脈注射BTC(0.5 μg/g體質量), 10 d后大鼠糖尿病狀態有所緩解, BTC治療組大鼠血

糖水平顯著低于對照組, 而血漿胰島素水平明顯高于非治療組, 持續時間長達4周, 治療30 d后病理學檢查證實BTC組大鼠胰島β細胞團較對照組的大, 胰島樣細胞團的數目明顯增多, 糖耐量試驗表明BTC治療的大鼠對糖刺激有很好的反應性[8]; 用鏈脲霉素制成的糖尿病小鼠注射BTC

后, 也取得了同樣的效果[9], Cho等[10]研究發現, BTC能促進人類胚胎干細胞向胰腺β細胞的分化由此可以推斷, BTC可能促進了β細胞的增殖或者是促進了胰腺干細胞增殖分化為β細胞, 分泌胰島素達到降低血糖的作用。

本研究中我們首先按照宋振順等的胰腺干細胞培養方法培養出大鼠胰腺干細胞, 并對其轉分化為胰島的情況做了初步研究。然后以該培養條件為對照, 在培養液中加入不同濃度的大鼠BTC, 結果發現, 在20~30 mg/L的條件下大鼠β細胞素能有效促進胰腺干細胞的增殖, 促進胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞, 為進一步研究糖尿病疾病的病因, 發病機制, 預防及治療等提供了一定的實驗依據。在本研究中, 當進一步增加β細胞素的劑量后, 胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團受抑制的原因, 我們認為是由于本實驗室在進行β細胞素的分子克隆中, 我們的蛋白質純化和復性工藝存在局限性, 因此, β細胞素的制劑中可能存在較多的無機鹽或其他雜質, 當增加β細胞素的劑量后, 可能對胰腺干細胞產生毒性作用, 在今后的工作中需要進一步改善蛋白質純化和復性工藝, 提高β細胞素的純度。關于β細胞素在體外促進胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團的分子機制, 目前尚不明確, 值得進一步研究。

參考文獻

[1]Soria B, Skoudy A, Martin F. From stem cell to beta cells: new strategies in cell therapy of diabetes mellitus[J]. Diabetologia, 2001, 44(4): 407-415.

[2]Dunbar AJ, Goddard C. Structurefunction and biological role of betacellulin[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2000, 32(8): 805-815.

[3]Miura K, Doura H, Aizawa T, et al. Solution structure of betacellulin, a new member of EGFfamily ligands[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 294(5): 1040-1046.

[4]安家澤, 宋振順, 竇科峰, 等. 大鼠β細胞素蛋白的表達、 純化及生物學活性鑒定[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2005, 21(3): 284-286.

[5]宋振順, 顧克菊. 成人胰腺干細胞轉分化為胰島細胞過程中的形態學觀察[J]. 外科理論與實踐, 2002, 7(3): 196-199.

[6]Gmyr V, Kerr2Conte J, Belaich S, et al. Adult human cytokeratin 19positive cells reexpress insulin promoter factor 1 in vitro: further evidence for pluripotent pancreatic stem cells in humans[J]. Diabetes, 2000, 49(10): 1671-1680.

[7]Li L, Seno M, Yamada H, et al. Promotion of betacell regeneration by betacellulin in ninety percentpancreatectomized rats[J]. Endocrinology, 2001, 142(12): 5379-5385.

篇(4)

關鍵詞:天然氣;催化燃燒;細胞;培養

中圖分類號:F407文獻標識碼: A

隨著我國大氣污染的日益嚴重,霧霾天氣區域性頻發,環境問題已變成當前棘手的問題[1]。天然氣催化燃燒能從源頭上防治污染和保護生態環境,有助于形成低投入“低消耗”低排放和高效率的節約型增長方式,有利于對消耗高“污染重”技術落后的工藝和產品實施淘汰,降低污染物排放總量,加強資源綜合利用,加強污染防治[2]。

天然氣屬于清潔能源,天然氣催化燃燒能達到CO和NOx均小于5ppm的近零污染物排放,是一種節能環保的燃燒方式。天然氣燃燒溫度在1000℃以上,燃燒后的煙氣無菌潔凈[3-4],對環境無污染,可將煙氣與空氣和CO2按照一定比例配比,配比后的氣體達到干細胞所需要的氣體成分,[5-7],由于高溫煙氣與空氣和CO2混合的,所以混合后的氣體潔凈無菌[4],可將其經過過濾和降溫通入無菌箱或超凈工作臺使工作區域潔凈無菌,也可將氣體通入到CO2培養箱中,應用到干細胞培養。

1.天然氣催化燃燒煙氣分析

中國計量科學研究院對天然氣催化燃燒煙氣檢測報告結果如表1所示:

表1 天然氣催化燃燒各組分氣體濃度

天然氣催化燃燒,燃料燃燒充分,并且其燃燒溫度在1100攝氏度左右,基本上全部轉為CO2和H2O,CO 和 NOx均小于5ppm,基本為零,由于天然氣中摻加極少量的H2S,燃燒產物為SO2和SO3,但其含量小于5ppm,幾乎為零,所以天然氣催化燃燒效率高,燃燒產物潔凈無菌,可將其用到無菌箱中。

2.干細胞培養所需氣體環境

除了滿足營養的需要以外,培養環境還必須具備細胞生存并繁殖的生理學能接受限度內的物理化學特性,包括溫度、氣相及PH等。

2.1溫度

體外培養的細胞需在保持一定恒溫的環境中才能生長,其適宜的溫度與取材的動物種類有關。

2.2氣相及pH

體外培養細胞需要理想的氣體環境。包括O2及CO2,但其量則須恰當。多數細胞需要在有O2條件下才能生長,氧張力通常維持在略低于大氣狀態,若O2分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。體外培養細胞采用開放培養時,其氣體環境一般應為5%CO2+95%空氣的混合氣體。大多數細胞適于在pH7.2~7.4條件下生長,低于pH6.8或高于pH7.6可能對細胞有害,甚至退變或死亡。

3.3 無污染及無毒

體外培養的細胞必須生長于無污染及無毒的環境。無毒是培養細胞的必需條件 [5]。

3. 催化燃燒煙氣在細胞培養上的應用

無菌箱或超凈工作臺是細胞培養中要使用的,催化燃燒煙氣作為潔凈無毒無污染的煙氣可作為無菌氣體持續不斷地通入無菌箱,可使無菌箱持續保持無菌的狀態[4],燃燒的煙氣與空氣、CO2按照一定比例混合后經過過濾降溫通入無菌箱可以持續的保持無菌箱的無菌狀態,我們將在無菌箱中對細胞操作完之后,將處理后的細胞放入CO2培養箱,傳統形式下需要一個5%的CO2瓶專門向CO2箱通入所需氣體,現在我們只需要將通入無菌箱的氣體通入CO2培養箱即可。

4. 實驗裝置

天然氣催化燃燒V型爐煙氣分析系統如圖1所示,本次實驗采用了兩塊獨石并排的催化燃燒V型燃燒器,所用獨石為堇青石蜂窩陶瓷,獨石內表面上鍍著鈀(Pd)和銠(Rh)催化劑,獨石采用正方形截面尺寸為150mm×150mm,厚度為20mm,獨石孔道尺寸1mm×1mm,壁厚0.18mm,軟化溫度為1380℃。

圖1. 天然氣催化燃燒V型爐系統圖

反應氣體天然氣和空氣分別通過量程為0~50 L/min 型號為GMS005 0BSRN200000的流量計和量程為0~80m3/h 型號為CMG400A080100000的空氣流量計進行調節,這兩個有穩流穩壓器提供電流。在催化燃燒器點火前需要對燃燒器內部的混合腔利用風機進行吹掃5 分鐘左右,來保證內部無殘留的燃氣。點火過程中,先將過量空氣系數調整到1.3左右進行氣相燃燒從而達到預熱的目的,期間觀察催化劑獨石表面待表面火焰基本消失且內部變為紅色時,將空氣量調大使過量空氣系數達到2.0左右,此狀態為催化燃燒的穩定燃燒狀態。此時,通過煙氣分析儀測量排放的煙氣,NO-NO2-NOx分析儀測量煙氣含量,待數據穩定后進行記錄。在箱體出口處插入熱電偶測量煙氣溫度。

5. 實驗結果分析

5.1 實驗結果

我們做了四組實驗分別是燃氣流量為6.1L/min 、7、8、9,相應的空氣流量為7.3m3/h、7.8、9.2、10.3,對應的空氣系數是2.09、1.94、2、2。圖2為記錄的煙氣成分CO、CO2、NOx濃度以及煙氣溫度。

圖2.不同燃氣流量下煙氣各成分濃度圖 3.不同燃氣流量下煙氣溫度

從圖2可以看出,NOx體積分數都在1ppm以下,CO體積分數在5ppm以下,接近于0,污染物含量極低,燃燒效果較好,CO2含量在5.7%上下,略高于細胞培養要求的5%,若將其應用到細胞培養必須改變CO2含量。從圖3可以看出,排煙溫度在300℃以上,接近400℃,與細胞培養要求的37℃相差甚遠,必須降溫。因此需要考慮將煙氣中通入某種氣體或者某幾種氣體將CO2和O2含量調節到細胞培養要求的含量。下面具體分析煙氣的主要成分。

5.2 天然氣組分說明

表 3-2 為通過氣相色譜儀所測得的實驗過程中所使用的天然氣組分及各組分的體積含量。

表1.天然氣各組分體積分數

5.21由于天然氣的主要成分是甲烷,所以天然氣燃燒的化學反應方程式如下[8]:

實驗用到的天然氣中甲烷占燃料總體積的 93%以上,所以實驗中是以甲烷的不完全燃燒情況進行了計算。所有含碳燃料在燃燒過程中都會產生CO這一中間產物。根據上述反應方程式可知,反應前后C原子個數是守恒的,反應后CO和CO2的總體積與反應前CH4的體積相等,即 。因為含量微乎其微,可以忽略不計,所以可以認為和燃燒前的含量相等,即;產生水蒸氣的量為,需要氧氣量,需要空氣量

煙氣總體積:

5.22 過量空氣系數為時,過量空氣相當于多出未參加燃料反應的那部分空氣產生的和水蒸氣的量不變,即,

過量空氣相當于多出未參加燃料反應的那部分空氣,煙氣中氧氣的體積:

煙氣的總體積:

干煙氣的總體積:

二氧化碳的體積分數:

氧氣的體積分數:

干煙氣中二氧化碳的體積分數:

氧氣的體積分數:

催化燃燒空氣的空氣系數是2,當過量空氣系數為2時,帶入上式

二氧化碳體積分數(煙氣中有水蒸氣):

氧氣體積分數(煙氣中有水蒸氣):

二氧化碳體積分數(煙氣中沒有水蒸氣):

氧氣體積分數(煙氣中沒有水蒸氣):

5.23 煙氣分析儀使用塑料管將氣體通入分析儀分析煙氣成分,在管道中煙氣降溫到室溫,水蒸氣冷凝,所以可以近似認為煙氣分析儀分析的氣體為干煙氣,數據計算CO2含量5.5%與實驗相當接近。

由于需要將煙氣中通氣體,雖然向濕煙氣中通氣體調節,但通入細胞培養儀器時的溫度為37℃,中間水蒸氣還會冷凝,所以調節氣體的體積分數時仍然需要按照干煙氣的計算調節。

對比煙氣成分含量與要求的成分含量可以看出,需要降低CO2含量,提高氧氣含量。因為氧氣提高到略低于21%所以可以通入空氣,即能提高O2含量又能降低CO2。假定煙氣總體積為V,通入空氣體積為Vx,則CO2體積為5.541,O2為11.082。

通過計算通入空氣后CO2含量會低于要求的含量,因此還需通入CO2,通入CO2體積為VY

將,,,

解得,

當煙氣的體積為V(不含水蒸氣)時,通入的燃氣量為0.0554V,空氣量為1.0554V,所以只要通入體積,燃氣量:空氣量:CO2量=0.0554:155;0.0523=1:2797:0.944時,輸出的煙氣的成分即為,。

6. 結論

天然氣屬于清潔能源,天然氣催化燃燒煙氣潔凈無菌,將燃燒廢氣收集重新利用通入CO2培養箱進行干細胞培養,此種方法使用即可以將煙氣充分利用,減少CO2排放,并且操作簡單,只需要向燃燒完的高溫煙氣中通入定量的空氣和CO2即可,而且從通入氣體的比例來看,生成需要的氣體向煙氣中通入的空氣很多,通入的CO2確很少,比較經濟,因此天然氣催化燃燒煙氣應用到細胞培養是種經濟環保的方式。

致謝

本資金由北京市供熱供燃氣通風及空調工程重點實驗室提供,項目編號cxy2012019。

參考文獻

[1] 王淑蘭,柴發合,高健. 我國中長期PM2.5污染控制戰略及對策[J]. 環境與可持續發展,2013,4:10-12

[2] 張世紅,Dupont Valerie,Williams Alan,Rickett Gavin. 硫化合物存在時天然氣催化燃燒機理與應用[M]. 科學出版社,2010:1-2

[3] 李寧. 化燃燒冷凝鍋爐熱效率及節能特性研究[D]. 北京建筑工程學院碩士學位論文,2011.03:1-3

[4] L. F. Yan, M. Xiao, S. H. Zhang Exploration of exhaust gas of natural gas[A]. Advanced Materials Research Vols. 581-582, (2012) pp.1172-1175

[5] 司徒鎮強,吳軍正. 細胞培養[M]. 世界圖書出版公司,2006:15-20

[6] 彭陽紅. 改良的氣體環境對體外骨髓間充質干細胞培養影響的實驗研究[D]. 第四軍醫大學博士學位論文,2008,05:2-4

篇(5)

據英國媒體報道,英國研究人員首次用3D打印機打印出胚胎干細胞,干細胞鮮活且保有發展為其他類型細胞的能力。我們知道,胚胎干細胞存在于胚胎發育早期的囊胚中,可發育為不同的細胞,是所有細胞最初期的形態。胚胎干細胞是萬能的,意味著它們可以發育成為身體內200多種細胞類型中的任何一種。研究人員說,這種技術或可制造人體組織以測試藥物,制造器官,乃至直接在人體內打印細胞。

胚胎干細胞3D打印機配備兩個“生物墨盒”,一個裝著浸在細胞培養基中的人體胚胎干細胞,另一個只有培養基。計算機控制微調閥噴出“墨水”,其速度可通過改變噴口直徑實現精確控制。

打印機上有顯微鏡,可以觀察細胞打印情況。兩種“墨水”一層一層間隔噴灑,形成不同濃度細胞飛沫,最小飛沫體積僅2納升,包含大約5個細胞。飛沫被噴入有諸多凹孔的培養皿中,翻轉培養皿,飛沫形成懸液,在各凹孔內“抱成團”。打印機可精確控制飛沫大小,使干細胞達到分化的最佳狀態。

研究人員在《生物制造》雜志說,檢測結果顯示,打印24小時后,95%以上細胞仍然存活,打印過程未殺死細胞;打印3天后,超過89%細胞存活,而且仍然維持多能性,即分化出多種細胞組織的潛能。

研究人員已經用3D打印的干細胞制造出骨髓和皮膚。他們認為,最終能借助這種方法制造器官,從而無需器官捐獻,同時還可以解決器官移植中的免疫抑制等問題。

篇(6)

[關鍵詞]毛囊干細胞;鑒定;分離培養

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455(2015)19-0077-04

The cultivation and identification of hair follicle stem cells

XIAO Feng1,TAN Jun2

(Department of Plastic and Laser Aesthetic Surgery,People's Hospital of Hunan Province,Changsha 410000,Hunan,China)

Abstract: Hair follicle stem cells are the ideal seed cells for skin tissue engineering,which has become a hot research topic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author will analyze and summarize several methods of isolation and culture of hair follicle stem cells in recent years.It will provide a solid foundation for the further study of hair follicle stem cells.

Key words:hair follicle stem cells;identification;cultivation

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞,存在于胚胎及成體內。在一定條件下,干細胞可以無限增殖而保持未分化狀態,也可以分化成多種功能細胞。20世紀,Cotsarelis、Taylor等[1]通過相關研究發現,在毛囊上部由外根鞘形成的明顯突起,即隆突區域也有干細胞的存在,這些干細胞被定義為毛囊干細胞。毛囊干細胞與其他成體干細胞一樣擁有強大的增殖能力及多向分化潛能[2]。毛囊干細胞能通過自身的分裂增殖產生各種機體所需的細胞,以補充脫落和缺失的細胞;毛囊干細胞不僅能夠向下轉移到毛囊根部生成毛囊,而且還能從毛囊外根鞘向上遷移,生成表皮和皮脂腺,并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年來,毛囊干細胞的研究備受關注,已成為研究熱點之一。目前,存在多種毛囊干細胞的分離培養及鑒定方法,為毛囊干細胞的深入研究提供了堅實的基礎,作者就毛囊干細胞常用的分離培養及鑒定作一簡要綜述。

1 毛囊干細胞的分離純化

此前,已有許多研究者采用不同的方法來分離毛囊干細胞,并成功地進行傳代培養,進行后續更深入的研究。目前對毛囊干細胞分離純化常用的有以下幾種方法:

1.1 組織塊培養法

取含有毛囊的皮膚樣本,清潔干凈,酒精消毒后用PBS液沖洗,將皮膚切成小塊,表皮朝上貼于加入適量培養基的培養器皿中,置于5%CO2培養箱中,37℃,飽和濕度條件下培養。組織塊培養法分離的干細胞能持續保持增殖趨勢,沒有明顯的平臺期,并且隨著不斷傳代純化,此方法獲得的毛囊干細胞純度明顯增加。但是組織塊培養法分離獲取毛囊干細胞的效率較低。史明艷等[5]使用該方法成功獲得毛囊干細胞,并分析指出該方法的優勢在于組織塊培養時從組織塊中遷移出來其他細胞為毛囊干細胞創造了一個類似于體內的微環境,使毛囊干細胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2 顯微分離技術

取含有毛囊的皮膚樣本,清潔干凈,除去皮下脂肪,酒精消毒后,使用含高濃度青、鏈霉素的PBS液反復沖洗3次;在超凈工作臺內,顯微鏡下顯微鑷鈍性分離單個毛囊組織,收集形態完好且處于生長期的毛囊。收集濾液離心(1 500r/min)10min,棄去上清,加入含培養基培養皿,于37℃、5%CO2孵箱中培養。顯微分離技術能從樣本直接選取毛囊干細胞相對富集區域,有利于后續進一步的純化[6]。王祝遷等[7]使用此方法成功分離出大鼠毛囊干細胞,但單純應用顯微分離技術獲取高純度的毛囊干細胞需花費大量的時間和精力,效率偏低。

1.3 酶消化法

取含有待培養毛囊的皮膚樣本,清潔干凈,酒精消毒后用含雙抗PBS液沖洗,將皮膚樣本剪成小塊,置于中性蛋白酶Ⅱ(0.25g/l)中,37℃搖床消化2h。取出組織用PBS沖洗3遍,置于胰蛋白酶(質量濃度為2.5g/l)和乙二胺四乙酸(0.2g/l)1∶1消化液37℃搖床消化1h后,過200目鋼網。收集濾液離心(1 500r/min)10min,棄去上清,加入細胞培養液培養。此方法獲得的毛囊干細胞克隆形成能力強,獲取效率高。鄭宣等[8]用此法獲得較純的毛囊干細胞,但獲得的毛囊干細胞經歷增殖期后生長速度逐漸減慢,且細胞存活率下降,可能與酶消化法破壞了毛囊干細胞生長微環境有關。

1.4 差數貼壁法

將收集的細胞接種于Ⅳ型膠原包被的培養皿中,靜置20min后,收集上層未貼附角質形成細胞和毛囊真皮成纖維細胞于另一培養皿中,貼附皿底的毛囊干細胞,置于體積分數為5%CO2、37℃孵箱中培養,每3d換液一次。與單純使用某種毛囊干細胞分離方法相比較,聯合差數貼壁法將更進一步純化,獲得純度更高的毛囊干細胞。彭等[9]使用酶消化法聯合差數貼壁法獲得了形態典型且均勻一致的毛囊干細胞。目前此方法已被廣泛使用。

1.5 免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用來純化分離培養獲得的毛囊隆突區細胞中某種標記物陽性的細胞。首先制作細胞懸液,并加入FITC標記的某種標記物單抗,室溫孵育30min,離心后棄上清中未結合的抗體,加入磁珠分選緩沖液重懸細胞,再次離心后棄上清,PBS緩沖液清洗2次,取重懸后細胞與免疫磁珠混合,室溫反應30min。磁珠分離器分離8min,去除未與磁珠結合的細胞。將結合了靶細胞的免疫磁珠用磁珠分選緩沖液洗5次。體積分數為5%CO2、37℃孵箱培養48h,使細胞與磁珠分離,即可獲得較純的毛囊干細胞。譚挺等[10]用此法獲得高純度毛囊干細胞,他們指出此方法與顯微分離技術連用有單次操作分離細胞數量大且純度較高、能與細胞培養、流式細胞術、熒光顯微鏡等分子生物學技術兼容等特點。黃恩毅等[11]用此法有效分離并成功培養CD34+毛囊干細胞,發現分選后的細胞仍具有較好的活性,且增殖速度快,增殖期長。盧葳等[6]通過實驗證實,免疫磁珠分選后毛囊干細胞活力較好,分離獲得的毛囊干細胞適合用于細胞培養、誘導等后續試驗。

1.6 流式細胞儀分選法

通過毛囊干細胞表達的某些特異性標記物,利用流式細胞儀可以將目的活細胞從異質性細胞群中分離出來,獲得較高純度的特異性細胞。常用的是熒光激活細胞分選器。盧葳等[6]使用流式細胞儀分選CD34+毛囊干細胞,獲得的毛囊干細胞純度很高、污染機會小,但是分選過程費時,細胞分選后活力稍差。此方法適合于需要做免疫組化,蛋白質組織學等對細胞純度要求高的實驗。

2 毛囊干細胞的鑒定

干細胞的鑒定一直是干細胞研究的難點,常用干細胞的標記物輔助方法進行鑒定。毛囊干細胞有多種明確的分子標記物,如CD34、K15、K19 [12]。

2.1 角蛋白家族

角蛋白是外胚層細胞的結構蛋白,廣泛存在于生物體的組織結構中。在表皮細胞中,它們以微絲的狀態在細胞內形成廣泛的網狀結構。在上皮組織中有20多種不同種類的角蛋白表達。在表皮細胞中,隨著分化程度的不同其所表達的角蛋白也不相同,因此角蛋白常作為毛囊干細胞的鑒定手段。1998年,lyle等[13]通過表達克隆發現K15是毛囊干細胞表面標記之一,此后K15一直被當做較為公認的毛囊干細胞標記物。20世紀末,有研究者通過實驗發現滯留細胞所在的毛囊隆突部細強表達K19[14];同時有實驗發現毛囊隆突部K19高表達細胞缺乏特異性分化標志,進一步證實 K19高表達細胞為毛囊干細胞,因此,認為K19也可作為毛囊干細胞表面標記物[15]。在毛囊干細胞分化過程中,K15表達減弱較K19早,K19表達陽性而K15陰性的細胞仍有可能為處于早期階段的增殖細胞,因此推測,檢測毛囊干細胞時K15更準確[13]。

2.2 鈣黏蛋白家族

鈣黏蛋白是一種同親型結合、Ca2+依賴的細胞黏著糖蛋白,對胚胎發育中的細胞識別、遷移和組織分化以及成體組織器官構成具有重要作用。不同細胞及發育不同階段其細胞表面的鈣黏蛋白的種類與數量均有所不同,目前已經發現幾十種鈣黏蛋白。CD34抗原是鈣黏蛋白中的一種,是一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白,為階段特異性白細胞分化抗原,CD34表達于人類造血干細胞,CD34是目前公認的造血干細胞標志物。Ohyama等[16]通過對鼠毛囊的研究,發現鼠毛囊中CD34陽性細胞與毛囊隆突部滯留細胞和K15陽性細胞在毛囊處位置一致,提示CD34可能也是可靠的毛囊干細胞標記物。Trempus等[17]通過動物實驗首次證實了CD34表達于小鼠毛囊干細胞。但CD34在人毛囊干細胞不表達,Shu Jiang等[18] 通過對人頭皮進行原位免疫組化和多色免疫熒光標記,發現CD34特異性表達于毛囊間表皮基底部。

2.3 整合素家族

整合素是機體重要的黏附分子,是廣泛存在于動植物細胞表面的一類細胞跨膜蛋白,在細胞與細胞外基質間及細胞與細胞間起黏附作用,整合素是由α和β兩個亞單位組成的異源二聚體,它們按不同的組合構成20余種整合素。目前,整合素也被廣泛用于毛囊干細胞的鑒定,常用的整合素為整合素β1。1995年,Jones等[19]根據表皮細胞表達整合素β1的水平將其進行分組培養,結果發現整合素β1高表達的表皮細胞比低表達者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年,Watt等[20]發現,富含整合素β1的皮膚基底細胞比整合素β1含量少的皮膚基底細胞能更快速的黏附細胞外基質蛋白,并具有更高的克隆形成能力,上述發現均為整合素β1作為毛囊干細胞特異性表面標記物提供有力支持。

3 結論

綜上,目前常用的分離培養方法主要包括:組織塊培養法、顯微分離技術、酶消化法、差數貼壁法、免疫磁珠法、流式細胞儀分選法,每種方法均有各自的優勢及缺陷;組織塊培養法簡單,但是分離純度不高,分離效率低下;顯微分離技術相對其他方法而言,分離純度高,但是分離過程比較費時費力;酶消化法效率高,但是酶消化過程同時會破壞細胞微環境,影響細胞存活率;差數貼壁法一般聯合其他分離純化方法,能進一步純化所獲毛囊干細胞;免疫磁珠法獲得的毛囊干細胞純度高、活性強,但是分離方法較復雜;流式細胞儀分選法所獲得毛囊干細胞純度高,但細胞活性低。因此,在選擇毛囊干細胞分離培養方法時一定要根據實驗的特殊要求及實驗條件選擇合適的方法。毛囊干細胞的鑒定方法常用的包括:角蛋白家族、鈣黏蛋白家族、整合素家族;實驗條件允許的情況下,同時檢測兩種以上的標記物來鑒定毛囊干細胞是較為準確的一種方法。

毛囊干細胞具有其他干細胞的共同特征,具有多向分化潛能。目前,已有實驗證實毛囊干細胞能用于尿道缺損、神經損傷的修復;能夠分化成為脂肪細胞和成骨細胞[1,21-22];能有效促進創面愈合,將其作為工程皮膚中的種子細胞,有利于表皮細胞及汗腺、毛囊等附屬器官的形成。另外,最新研究表明毛囊干細胞有利于瘢痕的修復,但該研究仍處于起步階段,相信經過研究者們的不懈努力,其必將為瘢痕治療這一世界性難題提供一種有效的新方法。

[參考文獻]

[1]趙奎,賈宗菲,弓慧敏,等.毛囊干細胞的分離方法及應用[J]. 中國畜牧獸醫,2010,37(12):82-85.

[2]Wu JC,Yang TT,Xu X,et al.Research on differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes invitro[J].J Med Postgra,2010,23(2):128-132.

[3]原璐,王春生,安鐵洙,等.毛囊干細胞研究進展[J].中國生物雜志,2009,29(1):75-79.

[4]Jaks V,Barker N,Kasper M,et al.Igr5 marks cycling, yet long-lived,hair follicle stem cells[J].Nat Genet,2008,40(11):1291-1299.

[5]史明艷,楊學義,竇忠英.山羊毛囊干細胞分離培養方法研究[J].畜牧獸醫學報,2006,37(5):436-440.

[6]盧葳,陳瑾,李惠.兩種純化大鼠毛囊干細胞方法的比較[J]. 重慶醫科大學學報,2010,35(1):124-126.

[7]王祝遷,木拉提?熱夏提,李佳,等.大鼠觸須毛囊干細胞的分離培養和鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(27):5031-5034.

[8]鄭宣,許世超,全仁夫.大鼠毛囊干細胞的體外培養及相關檢測的實驗研究[J].中國中醫骨傷科雜志,2014,22(2):8-14.

[9]彭,王玉杰,李佳,等.不同體積分數富血小板血漿與大鼠毛囊干細胞的增殖[J]. 中國組織工程研究,2012,16(45):8501-8505.

[10]譚挺,胡志奇,周洪軍.顯微分離培養與免疫磁珠法分離純化人毛囊干細胞[J].中國修復重建外科雜志,2008,22(2):202-205.

[11]黃恩毅,楊恬,陳偉,等.毛囊干細胞的純化培養鑒定及其生物學特性[J].第三軍醫大學學報,2008,30(1):39-42.

[12]Tsai SY,Clavel C,Kim S,et al.Oct4 and klf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells[J].Stem Cells,2010,28(2):221-228.

[13]Lyle S,Christofidou-Solomidou M,Iiu Y,et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the 10- 8 cation of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci,1998,111:3179-3188.

[14]Michel M,Torok N,Godbout MJ,et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially 10 calized in function of anatomic sites,and their number varies with donor age and culture stage[J].J Cell Sci,1996,109:1017-1028.

[15]Reynolds AJ,Jahoda CA.Hair follicle stem cells A distinct germinative epidermal cell population is active in vitro by the presence of hair dermal papillar cells[J].J Cell Sci,1991,99:373-385.

[16]Ohyama M,Terunuma A,Tock CL,et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].J Clin Invest,2006,116(1):249- 260.

[17]Trempus CS,Morris RJ,Bortner CD,et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34[J].J Invest Dermatol,2003,120(4):501-511.

[18]Shu Jiang,Longmei Zhao,Bhamini Purandare,et al. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments[J]. Histochem Cell Biol, 2010,133:455-465.

[19]Jones PH,Harper S,Watt FM. Stem cell patterning and fate in human epidermis[J].Cell,1995,80(1):83-93.

[20]Watt FM.Epidermal stem cells:markers,patterning and the control of stem cell fate[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,1998,353(1370):831-837.

[21]蔡霞.人毛囊干細胞的分離培養鑒定與生物學特性的初步研究[J].四川醫學,2014,35(1):1-3.

篇(7)

目的: 利用簡化無血清培養基和連續傳代法,從成體小鼠腸管分離培養腸神經嵴干細胞(GNCSCs),觀察細胞體外培養過程中增殖、分化的特點. 用p75, GFAP,Peripherin,αActin作為特異性標志來鑒定GNCSCs及其分化的細胞系. 方法: 將新生1, 5 d的小鼠腸管制成單細胞懸液,接種于無血清DMEM/F12完全培養基中貼壁培養,連續傳代培養并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養基中,觀察其分化現象. 用免疫細胞化學和免疫熒光法檢測克隆球及其分化細胞系特異性標志物的表達. 結果: 成體小鼠腸管中有少數細胞在無血清培養基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導下可分化為神經元、神經膠質細胞、平滑肌細胞. 結論: 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs,在體外GNCSCs可分化為腸神經系統所必須的細胞類型.

【關鍵詞】 腸神經嵴干細胞 小鼠 細胞培養技術 細胞分化 Hirschsprung病

0引言

應用神經干細胞治療某些神經系統的損傷和退行性疾病,經過較長時間的實踐已被證明是行之有效的[1]. 腸神經嵴干細胞(gut neural crest stem cells, GNCSCs)起源于神經管背側,具有干細胞特性[2],將其用于治療先天性巨結腸癥及腸神經系統干細胞疾病的研究已引起人們的關注,本實驗著重進行GNCSCs的基礎研究,為臨床應用建立理論基礎.

1材料和方法

1.1材料新生1,5 d昆明小白鼠,15只,體質量不拘,西安交通大學醫學實驗動物中心提供. ① DMEM/F12完全培養基(Gibco)組成:B27添加劑(Gibco),N2添加劑(Gibco),重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF, vitrogen), β巰基乙醇(Sigma),青霉素和鏈霉素(華北制藥). ② 促分化培養基組成:DMEM/F12完全培養基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他:胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶(Sigma),左旋多聚賴氨酸(Sigma). 一抗:兔抗小鼠NGFRp75(武漢博士德)、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon),兔抗GFAP多克隆抗體(DAKO),鼠抗小鼠αActin單克隆抗體(Sigma)SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(博士得生物工程有限公司). 二抗為TRITC標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養頸椎脫臼法處死2組小鼠,將其腸管放入Hanks,清洗,機械分散腸管組織,胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min,10 min,終止消化后反復吹打制成單細胞懸液,用200目,400目的濾網過濾,以800 r/min 離心 5 min,棄上清,用預先配置的無血清完全培養基重懸細胞,臺盼藍染色計數活細胞,以 6×108個/L接種到25 mL培養瓶中,添加培養基至4 mL. 在37 ℃, 50 mL/ L CO2,飽和濕度培養箱中水平放置,貼壁培養. 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細胞,以2/3量換液,孵育3 d后進行傳代,以6×108個/L接種到25 mL培養瓶中,繼續孵育40~48 h后再次傳代,如有細胞團塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代,3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養基重懸傳代5次后的克隆球,接種于放置有預先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養皿內,每皿2 mL,動態觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細胞特異性標志物的染色應用p75NTR, GFAP, Peripherin,αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細胞系的性質,封片后分別用光學顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

轉貼于

2結果

2.1克隆球的生長狀況接種初期,倒置顯微鏡下觀察到單細胞和一些呈半球狀或不規則的細胞團. 孵育24 h后,貼壁細胞胞呈圓形,胞體小,折光性好,部分貼壁細胞胞體增大,折光性增強,出現分裂相,形成2~5個細胞的細胞團,另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數十個細胞構成的克隆球(圖1A),克隆球增大的同時向周圍伸出放射狀的細胞索,形成較小的次級克隆,這些克隆球形態完整,折光性減弱,周邊界線清晰,但其中心密集,界限不清,無法觀察到完整的細胞結構 (圖1B). 重新傳代培養,可觀察到細胞胞體增大,出現分裂相的克隆球數量逐漸增多,雜質細胞減少,在連續傳代過程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養基12 h后,可見有細胞從克隆球中遷出,遷出的細胞貼壁生長;24 h后克隆球變扁,遷移出的細胞增多,相差顯微鏡下難以分別形態;48 h后貼壁細胞數量明顯增加,逐漸形成單細胞層且細胞形態多元化.

2.3克隆球及其分化細胞系的免疫染色免疫細胞化學方法進行p75, Peripherin, GFAP, αActin免疫染色(圖1C,圖2, 3).

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發生和發育起關鍵作用[3-4]. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關[4-5],在RET等基因缺失模型中, GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發生障礙,受累腸道的相應神經節出現缺失,表明先天性巨結腸可能是一種干細胞疾病. 由于HSCR及腸神經系統干細胞性疾病在手術治療后仍遺留有嚴重的并發癥,因此用干細胞來進行臨床治療已成為研究的熱點和重點. 鑒于胚胎干細胞的來源限制及免疫排斥問題,成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗提供新契機.

GNCSCs的培養方法建立在中樞神經干細胞的基礎上. 依據神經干細胞經典的培養方法,再結合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點,聯合應用簡化的特殊培養劑和神經干細胞培養方法進行體外培養. 連續傳10代后,GNCSCs的相對比例明顯增加,這種體外培養的方法能有效地分離和純化GNCSCs,但并不能完全消除其他細胞. 如果繼續傳代,其純化程度越高,后續的試驗效果將更佳. 連續傳代不僅純化了GNCSCs,還證實了干細胞的自我更新特性. 在體外培養干細胞時,培養條件稍有變化可導致分化機制的啟動,因此采用血清促分化法誘導GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色,證實了GNCSCs分化細胞的類型,同時顯示了分化的亞型神經元及神經膠質細胞的形態,并表明了成體干細胞的多向分化能力.

參考文獻

[1] 楊帆,楊樹源. 神經干細胞研究進展及臨床應用前景[J].醫學綜述, 2002;8(8):491-493.

[2] Newgreen D, Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2[J]. Pediatr Dev Pathol,2002, 5(4): 329-349.

[3] Natarajan D, Grigoriou M, MarcosGutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture[J]. Development 1999, 126(1):157-168.

相關文章
主站蜘蛛池模板: 亚洲乱码日产精品bd在线下载 | 99亚洲精品卡2卡三卡4卡2卡 | 精品91久久久 | 日日婷婷夜日日天干 | 一级一级国产片 | 亚洲人免费| 亚洲人成自拍网站在线观看 | 亚洲成a×人片在线观看 | 黑人巨大videos精品 | 国产成人高清精品免费软件 | 五月激情四射婷婷 | 美女脱了内裤张开腿让男人桶网站 | 最新亚洲伦理中文字幕 | 视频在线你懂的 | 伊人中文在线最新版天堂 | 精品国产免费人成电影在线看 | 97福利影院 | 亚洲春色av无码专区在线播放 | 综合视频一区 | 在线视频第一页 | 久久国产天堂福利天堂 | 亚洲精品无码ma在线观看 | 欧美日韩理论 | 在线观看亚洲专区 | 日韩精品一卡二卡3卡四卡2 | 免费无码成人av片在线在线播放 | 免费人成在线视频无码软件 | 亚洲色中文字幕在线播放 | 婷婷夜夜躁天天躁人人躁 | 中文在线视频 | 强开乳罩摸双乳吃奶网站 | 三上悠亚福利一区二区 | 国产精品9999久久久久仙踪林 | 久久久精品人妻一区亚美研究所 | 丰满无码人妻热妇无码区 | 最新日韩av| 亚洲中文有码字幕日本 | 一级精品视频 | 国产精品推荐制服丝袜 | 人人av在线| 国产亚洲日韩在线a不卡 | 欧美黑人疯狂性受xxxxx喷水 | 精品久久久久久无码人妻蜜桃 | 欲香欲色天天综合久久 | 国产男人的天堂在线视频 | 91免费视频网 | 亚洲麻豆一区二区三区 | 青青草av一区二区三区 | 97se亚洲国产综合自在线 | 热99精品 | 亚洲日韩欧洲无码av夜夜摸 | av大片网站| 韩国视频高清在线观看 | 久久人人爽人人爽 | 中文字幕无码专区人妻制服 | 农村妇女一区二区 | 120秒试看无码体验区 | 亚洲日本天堂 | 亚洲全国最大的人成网站 | 特级无码毛片免费视频播放▽ | 亚洲国产成人无码av在线播放 | 女人毛毛片 | 欧美性色黄大片手机版 | 热久久99这里有精品综合久久 | 国产免费无码一区二区 | 色黄视频网站 | 国产成人拍拍拍高潮尖叫 | 久久久妻 | 小妖精又紧又湿高潮h视频69 | 午夜在线欧美蜜桃 | 热热色国产 | 日韩中文字幕综合 | 伊人久久五月 | 伊人色综合影院 | 1000部啪啪未满十八勿入不卡 | 无码爆乳超乳中文字幕在线 | 国产嫖妓一区二区三区无码 | 欧美福利视频一区二区 | 欧美不卡无线在线一二三区观 | 女学生和老头做爰av片 | 亚洲成aⅴ人在线视频 | 亚洲综合久久成人a片红豆 黄色在线免费播放 | 国产成人天天5g影院在线观看 | www.亚洲天堂 | www.久久久久久久久久久 | 亚洲综合在线一区二区 | 久久久无码精品亚洲日韩蜜臀浪潮 | 狠狠色丁香五月综合缴情婷婷五月 | 中文字幕人妻不在线无码视频 | 男男车车的车车网站w98免费 | 久久久亚洲一区二区三区 | 国产精品久久久久久久久久黑人 | 亚洲精品伊人久久久大香 | 永久免费的av在线电影网 | 欧美一区二区视频在线播放 | 成人精品国产区在线观看 | 中文字幕在线视频观看 | 成人国产一区二区三区 | 中文字幕资源网 | 久久影院午夜伦手机不四虎卡 | 久久伊人婷婷 | 色婷婷六月亚洲婷婷丁香 | 在线免费观看你懂的 | 国精产品一区一区三区 | 精品国产免费久久久久久桃子图片 | 欧美成人精品高清视频在线观看 | 男男女女爽爽爽免费视频 | 永久免费无码国产 | 欧美理伦黑寡妇艳妇 | 热久久免费视频 | 成人在线短视频 | 国内成人免费视频 | 日日骚视频 | 亚洲vs天堂 | 国产精品麻豆欧美日韩ww | 日韩成人免费观看 | 97超碰伊人 | 一本大道香一蕉久 | 亚洲欧洲成人精品久久一码二码 | 丰满少妇三级全黄 | 野外少妇愉情中文字幕 | 日韩精品久久久肉伦网站 | aa亚洲| 免费激情网站 | 国产伦理久久 | 国产亚洲精品一区二三区 | 黄毛片视频 | 精品无码一区二区三区爱欲 | 山东熟女啪啪哦哦叫 | 国产日韩欧美一区二区宅男 | 无码中文字幕人妻在线一区二区三区 | 国产精品熟女在线视频 | 午夜福利影院私人爽 | 亚洲中文字幕无码乱线久久视 | 精品一区二区三人妻视频 | 色翁荡熄又大又硬又粗又视频 | 99riav国产精品视频 | 91久久爱 | 一级特黄欧美 | 亚洲男生自慰xnxx | 草草久久97超级碰碰碰 | 91丨九色丨91啦蝌蚪老版 | 先锋影音中文字幕 | 亚洲天堂2015 | 在线欧美激情 | 无码人妻一区二区三区免费 | 中文字幕大香视频蕉免费 | 国精产品久久 | 国产精品入口网站7777 | 老司机精品无码免费视频 | 成人h动漫精品一区二区器材 | jizz毛片 | 国产日韩三级 | 五月婷之久久综合丝袜美腿 | 91精品视频免费看 | 国产高清在线精品一区app | 91爱爱爱爱| 视频国产在线 | 亚洲宅男天堂 | 手机av不卡 | 国产aaa大片 | 免费的污污的网站在线观看 | 久久久免费精品视频 | 日韩成人无码片av网站 | 67194成在线观看免费 | 伊人亚洲综合网色 | 午夜男女无遮挡拍拍视频 | 亚洲欧洲精品成人久久曰 | 欧美成人一区二区三区在线观看 | 四虎影视88aa久久人妻 | 天堂乱码一二三区 | 五月天激情婷婷婷久久 | 欧美综合色免费 | av免费观看入口 | 日韩aaa久久蜜桃av | 国产精品亚洲欧美大片在线观看 | 91官网入口 | 国产成人高清视频 | 亚洲欧美999 | 色爱区综合五月激情 | 91污在线| 久久不见久久见免费视频1′ | 成人免费网站入口www | 亚洲精品久久久久999中文字幕 | 亚洲一区二区三区国产 | 精品一区在线 | 国产精品18久久久久久首页狼 | 巨乳在线播放 | 97色在线 | 狠狠干b | 亚洲国产最大av | 无套内射在线无码播放 | 三级精品在线 | 亚洲日韩国产成网在线观看 | 午夜爽爽影院理论片午夜梦回 | 成熟了的熟妇毛茸茸 | 孕妇做爰xxxx呻吟 | 12av在线| 国产成人一区二区精品视频 | 久久久久se色偷偷亚洲精品av | 欧美精品久久久久a | 免费观看又色又爽又湿的软件 | 夜夜夜夜夜猛噜噜噜噜噜gg | 日韩av片在线播放 | 国产在线播放一区 | 精品视频一区二区三三区四区 | 亚洲国产日韩视频观看 | 91丨国产丨白丝 | 伊人久久九| 人人妻一区二区三区 | 尤妮丝大尺度av在线播放 | 天天色天天 | 少妇伦子伦精品无吗 | 91色综合 | 欧美色五月 | 欧美性黑人极品hd另类 | 午夜精品久久18免费观看 | 成人福利免费视频 | 日本午夜精品一区二区三区电影 | 天天色成人 | 天天综合网日韩 | 少妇裸体长淫交视频免费观看 | 日韩在线免费观看av | 夫妻免费无码v看片 | 成人网站免费观看 | 亚洲乱人伦 | 久热精品视频在线 | 国产超碰人人模人人爽人人喊 | 狠狠色噜噜狠狠米奇777 | av片亚洲国产男人的天堂 | 天天爱天天做狠狠久久做 | 亚洲午夜伦理 | 婷婷一区二区三区 | 欧美亚洲另类自拍 | 欧美综合激情网 | 真人无码国产作爱免费视频 | 亚洲精品国产suv一区 | 国产精品免费久久久久电影 | 免费不卡无码av在线观看 | 极品少妇被猛得白浆直喷白浆小说 | 乱人伦人妻中文字幕不卡 | 日韩人妻熟女中文字幕 | 成人网站色52色在线观看 | 亚洲色大成网站www久久九 | 国产精品色一区二区三区 | 九一亚色视频 | 老司机午夜精品99久久免费 | 中文字幕一区二区三区四区欧美 | 91老女人 | 91久久久久久久久久久 | 亚洲熟妇久久精品 | 在线影院av | 79年熟女大胆露脸啪啪对白p | 女人下边被添全过视频 | 国产精品国产精品国产专区不蜜 | 山东熟女啪啪哦哦叫 | 999.av| 黑人粗大猛烈进出高潮视频 | 欧美人成视频在线视频 | 黄色视频毛片 | 亚洲一区av无码少妇电影 | 国产亚洲不卡 | 一个人免费观看视频www中文 | 国产精品中文原创av巨作首播 | 区一区二视频 | 99久久成人 | 国产精品久久久久久久久齐齐 | 我要看www免费看插插视频 | 国产欧美日韩一区二区三区 | 日本一本免费一二区 | 国产亚洲日韩a欧美在线人成 | 无码国产成人午夜视频在线播放 | 中文字幕 亚洲 无码 在线 | 蜜桃视频插满18在线观看 | 日韩精品一区二区三区丰满 | 性xxxx丰满孕妇xxxx另类 | 男女啪啪无遮挡免费网站 | 亚洲精品av网站在线观看 | 成人免费黄 | 亚洲国产精品久久人人爱潘金莲 | 96av麻豆蜜桃一区二区 | 少妇人妻88久久中文字幕 | 国产精品久久久久久亚洲 | 99国产视频 | 一区二区 中文字幕 | 成码无人av片在线电影网站 | 乱色欧美| 日本在线视频不卡 | 中文无码人妻有码人妻中文字幕 | 国产白嫩受无套呻吟 | 亚洲国产精品国自产拍张津瑜 | 亚洲国产一区自拍 | 国产精品欧美久久久久久日木一道 | 天天操狠狠操夜夜操 | 九九九九精品九九九九 | 好男人资源在线社区 | 伊人网在线视频观看 | 国产精品久久久久久模特 | 97久久精品无码一区二区天美 | 精品国产一区二区三区四区色 | 夜夜穞天天穞狠狠穞 | 伊人成人在线观看 | a级特黄一级一大片多人 | 午夜免费视频观看 | 四虎影视精品永久在线观看 | 亚洲第一视频在线观看 | 手机看片成人 | 青青成人网 | 香蕉av777xxx色综合一区 | 国产午夜视频在线观看 | 91九色视频在线 | 国产精品太长太粗太大视频 | 欧美免赞性视频 | 久久狠 | 自拍偷自拍亚洲精品牛影院 | 欧美少妇一级片 | 999在线视频 | 中文字幕高潮 | 欲香欲色天天综合久久 | 少妇99在线观看 | 男人的天堂网在线观看 | 亚洲欧美日韩国产自偷 | 亚洲精华国产精华精华液网站 | 乱视频在线观看 | 97国产精品一区二区 | 国产 日韩 一区 | 经典国产乱子伦精品视频 | 538国产视频 | 第一福利在线观看 | 国产日产成人免费视频在线观看 | 日本内谢少妇xxxxx8老少交 | 国产偷抇久久精品a片蜜臀av | 亚洲精品伊人久久久大香 | 欧美在线观看你懂的 | 激情午夜视频 | 国产精品久久自在自线不卡 | 欧美国产日韩a欧美在线视频 | 亚洲国产成人精品久久久国产成人一区 | 亚洲国产呦萝小初 | 鲁一鲁一鲁一鲁一av卡三 | 色男人av | 99re久久精品国产 | 暴雨入室侵犯进出肉体免费观看 | 日韩av免费播放 | 无码av免费一区二区三区a片 | 九九99久久精品在免费线18 | 国产第一页第二页 | 国产97碰免费视频 | 激情av综合网 | 久久99久久久 | 又爽又黄无遮挡高潮视频网站 | 天天超碰 | 亚洲狠狠操 | 日韩区欧美久久久无人区 | 少妇真人直播免费视频 | 日韩精品中文字幕一区二区三区 | 91国内自产精华天堂 | 99久久人人爽亚洲精品美女 | 无码人妻巨屁股系列 | 欧美日韩成人一区二区在线观看 | 韩国激情高潮无遮挡hd | 欧洲美女与动性zozozo | 动漫精品一区二区 | 国产在线欧美 | 国产交换配乱婬视频偷网站 | 欧美疯狂黑人xxxxbbbb | 青娱乐极品视觉盛宴av | 精品国产肉丝袜久久首页 | 午夜视频一区二区 | 欧美日韩精品一区 | 成人福利av | 国产51页 | 尤物视频在线播放 | 爱爱毛片 | 天天做天天爱 | 尤物爽到高潮潮喷视频大全 | 亚洲永久精品在线观看 | 99在线成人精品视频 | 国产精品国产高清国产av | 国产精品久久久久久久网 | 国产精品色内内在线播放 | 欧美三级中文 | 91久久人澡人人添人人爽欧美 | 亚洲第一黄色 | 日本肉体裸xxxxbbbb | 性俄罗斯交xxxxx免费视频 | 成年无码按摩av片在线观看 | 午夜网站在线 | 亚洲老少妇 | 自拍日韩亚洲一区在线 | 综合无码一区二区三区四区五区 | www.狠狠艹 | 国产精品偷伦视频免费观看的 | 久久窝窝 | 国产视频一区在线播放 | 久久天天躁夜夜躁狠狠躁综合 | 午夜影音 | 男ji大巴进入女人的视频小说 | 在线看片免费人成视频在线影院 | 日本老熟妇乱子伦精品 | 午夜精品一区二区三区在线观看 | 中文字幕一区三区 | 奇米影视777四色米奇影院 | 国产精品疯狂输出jk草莓视频 | 巨大巨粗巨长 黑人长吊 | 97夜夜澡人人爽人人模人人喊 | www.99c0m成人| 日本视频www色 | 少妇av一区二区 | 久久久久久aaaabbbb | 亚洲人成网站在线在线观看 | 久久久.www | 欧美乱妇15p | 亚洲情侣在线 | 欧美熟妇色ⅹxxx欧美妇 | 久久久99精品 | 又粗又黄又爽视频免费看 | 日韩福利视频在线 | 91网页入口 | 午夜久久久久久久久久久久久捆绑 | 18禁美女黄网站色大片在线 | 99久久精品免费看国产免费粉嫩 | 99久久99久久久精品棕色圆 | 欧美老熟 | 曰本av中文字幕一区二区 | 性色av一区二区三区免费看开蚌 | 国产激情久久久久久熟女老人 | 欧美激情片在线观看 | 熟睡中被义子侵犯在线播放 | 最新版天堂资源中文在线 | 亚洲九九九 | 高潮毛片又色又爽免费 | 无码专区中文字幕无码野外 | 中文无码乱人伦中文视频在线v | 成人无码a片一区二区三区免 | 在线 偷窥 制服 另类 | 777米奇色狠狠888俺也去乱 | 国产熟妇乱xxxxx大屁股网 | 国产又色又爽又黄好看视频 | 男女猛烈无遮挡免费视频在线观看 | 亚洲国产成人第一天堂 | 性av网 | 亚洲欧洲精品专线 | 久久久久久高潮国产精品视 | 日本成人福利 | 久久久久xxxx | 成人免费crm一区二区 | 国产精品一区二区在线播放 | 午夜理论无码片在线观看免费 | 97国产精品人妻无码久久久 | 久久精品国产精品久久久 | 91精品国产综合久久婷婷香蕉 | 波多野结衣乳巨码无在线 | 妺妺窝人体色www看人体 | 88av在线播放 | 久久久久久无码日韩欧美 | 日本福利一区二区 | 国产日产suv精品一区二区6 | 日本欧美国产 | 亚洲国产精品一区第二页 | a在线天堂| 国产精品白丝喷水娇喘视频 | 欧美40老熟妇色xxxxx | 欧美99久久精品乱码影视 | 精品久久久免费视频 | 精品亚洲综合成人网 | 亚洲国产日韩欧美在线 | 亚洲精品鲁一鲁一区二区三区 | 亚洲乱码av中文一区二区 | 日韩欧美高清一区 | 色橹橹欧美在线观看视频高清 | 亚洲一区在线观 | 国产一区二区欧美 | 五月色婷婷综合 | 国产一精品一av一免费 | 国产一区免费 | 国产日韩免费 | 久久天天东北熟女毛茸茸 | 精品人妻无码一区二区色欲产成人 | 国产欧美一区二区三区四区五区 | 国产aⅴ爽av久久久久电影渣男 | 侵犯の奶水授乳羞羞游戏 | 国产在线日韩拍揄自揄视频 | 天天做天天爱夭大综合网 | 亚洲va久久久噜噜噜久久 | 老熟女乱子伦 | 亚洲永久网站 | 午夜男女爽爽爽在线视频 | 国产精品9999久久久久 | 亚洲精品成a人在线观看网站 | 亚洲国产欧美在线观看 | 国产va免费精品观看精品 | 国产成人亚洲综合色婷婷秒播 | 日韩a无v码在线播放 | 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 | 亚洲永久网址在线观看 | 51福利视频| 国产色xx群视频射精 | 亚洲偷自拍另类图片二区 | 四月天中文字幕综合网 | 久国产 | 国产精品 高清 尿 小便 嘘嘘 | 久久91久久久久麻豆精品 | 高清精品xnxxcom | a级在线观看| 天天操天天色综合 | 99热这里只有精品4 欧美色成人 | 少妇挑战黑人高潮惨叫 | 欧亚一区二区三区 | 欧美三级在线播放线观看 | 东京天堂网天堂网 | 国产剧情自拍 | 国产激情精品视频 | 亚洲视频免费在线播放 | 国产色视频一区二区三区qq号 | 亚洲成a人片在线观看天堂无码不卡 | 四虎影视免费永久大全 | 国产高潮久久久久久绿帽 | 日日草夜夜 | 日本久久高清一区二区三区毛片 | 国产精品午夜福利不卡120 | 伊人网在线视频 | 黄色激情小说视频 | 一个色综合久久 | 亚洲人成手机电影网站 | 日韩美女网站 | 国产suv精品一区二区五 | 亚洲αv无码一区二区三区四区 | 久久久激情 | v11av在线播放 | 超碰网站在线观看 | 欧美福利视频在线 | av黄网| 日本少妇肉体裸交xxx | 福利在线免费视频 | 午夜免费无码福利视频 | 99久久99热这里只有精品 | 国产亚洲日韩一区二区三区 | 2020无码专区人妻系列日韩 | 欧美人与禽猛交狂配 | 婷婷91欧美777一二三区 | 国产天堂久久天堂av色综合 | 精品国产乱码一区二区三 | 337p日本欧洲亚洲大胆人人 | s级爆乳玩具酱国产vip皮裤 | 久久久妻 | 无码人妻一区二区三区在线视频 | 奇米色综合 | avaiai| 国产无套粉嫩白浆内精在线网站 | 国产免费一区二区三区最新6 | 亚洲愉拍自拍另类图片 | 国产欧美亚洲精品第1页青草 | 无码任你躁久久久久久老妇蜜桃 | 国产精品igao视频网免费播放 | 少妇被多人c夜夜爽爽 | 亚洲女人被黑人巨大进入 | 午夜国内精品a一区二区桃色 | 日韩欧美亚洲综合久久影院 | 天天夜夜狠狠 | 成人wwwxxx视频 | 国内精品久久久久影视 | 久久国内精品视频 | 日本三级免费网站 | 国产对白农村老女人性视频对话 | 久久久精品94久久精品 | 欧美日韩久久久 | 午夜剧场免费在线观看 | 欧美激情精品成人一区 | 国产日日夜夜 | 亚洲精品午夜精品 | 国产偷久久一级精品60部 | 久久大香香蕉国产拍国 | 国产高清在线自在拍网站 | 人人玩人人添人人澡97 | 欧美人与动牲交zooz乌克兰 | av国内精品久久久久影院 | 久久久久久av无码免费网站下载 | 亚洲成av人片在线观看无下载 | 69天堂人成无码免费视频 | 国产免费高清69式视频在线观看 | 国内老熟妇乱子伦视频 | 蜜桃又黄又粗又爽av免 | 国产又粗又硬又大爽黄 | 国产精品久久自在自线不卡 | 伊人久久大香线焦av色 | 麻豆aⅴ精品无码一区二区 国产热视频 | 又湿又紧又大又爽a视频国产 | 亚洲欧美日本一区二区三区 | 777色网| 国产久9视频这里只有精品 极品美女扒开粉嫩小泬图片 | 免费久久久 | 欧美成人观看 | 91丨九色| 欧美xx网站 | 老汉av网站 | 蜜臀av性久久久久蜜臀aⅴ麻豆 | 免费av在线| 色噜噜狠狠成人中文 | 含羞草传媒mv免费观看视频 | 91精品国产综合久久国产大片 | 亚洲成a人v欧美综合天堂下载 | 午夜一二区 | 日本偷偷操 | 婷婷色婷婷深深爱播五月 | 色999韩| 青青草视频在线免费观看 | 一本一道人人妻人人妻αv 开心激情婷婷 | 久久99国产乱子伦精品免费 | 午夜宅男影院 | 成人精品自拍 | 亚洲 欧美 日韩 综合aⅴ电影 | 波多野结衣操 | 欧洲三级在线 | 男人插女人b视频 | 亚洲欧美另类在线图片区 | 99er国产这里只有精品视频免费 | 9l视频自拍九色9l视频大全 | 牛牛在线视频 | 中国a一片一级一片 | 在线观看欧美视频 | 亚洲中文字幕人成影院 | 天天干天天干天天干天天干天天干 | 中国极品videossex少妇 | 手机免费在线观看av | 亚洲三区在线观看无套内射 | 久草欧美 | 夜夜夜夜夜操 | 热99re6久精品国产首页 | 久久久久久亚洲精品a片成人 | 国产啪视频1000部免费 | 国产欧亚州美日韩综合区 | 啪啪高潮动态图 | 91精品一本久道久久丁香狠狠躁 | 欧美黑人一级视频 | 精品无码三级在线观看视频 | 亚洲精品一区国产 | 亚洲精品国产精品乱码不卞 | 日日夜夜骑 | 丁香激情五月 | 国产娇喘视频 | 一级大片免费观看 | 大番蕉尹人一线久久 | 在线视频网 | 中文字幕一本性无码 | 亚洲中文字幕无码永久在线 | 91av小视频 | 男女啪啪免费观看的网址 | 欧美性色大片在线观看 | 欧美国产免费 | 国产第二专区 | 中文字幕欧美视频 | 久久亚洲精品高潮综合色a片 | 69精品久久久 | 青青在线视频 | 国产黑色丝袜在线看片不卡顿 | 青青草国产成人av片免费 | 亚洲一区二区三区高清在线看 | 久操福利视频 | 国产女人成人精品a区 | www.成人国产 | 国产成人乱码一二三区18 | 亚洲色拍拍噜噜噜最新网站 | www.97视频| 嫩草影院中文字幕 | 国产成人无码视频一区二区三区 | 男人舔女人下面高潮视频 | 亚洲精品综合一区二区 | 国产人妖视频一区二区, | 人妻无码av一区二区三区精品 | 四虎影片 | 久久久国产精华 | 亚洲人成在线播放无码 | 免费观看全黄做爰大片国产 | 日韩久久激情 | 国产熟妇久久777777 | 三级理论中文字幕在线播放 | 欧美和黑人xxxx猛交视频 | 久久草在线视频播放 | 超碰97干 | 性久久久久久久 | 成人永久免费 | 久久国产乱子伦精品免费台湾 | 亚洲午夜成人精品无码色欲 | 国产黄色在线播放 | 亚洲精品久久久久中文字幕一福利 | 国产精品15p | 无码高潮喷吹在线播放亚洲 | 一本色综合 | 色综合色综合久久综合频道88 | 欧美日韩中文字幕视频不卡一二区 | 亚洲精品乱码久久久久久app | 男女裸交无遮挡啪啪激情试看 | gav成人网免费免播放器播放 | 久草在线在线精品观看 | 96亚洲精品久 | 国产一级免费大片 | 亚洲色帝国综合婷婷久久 | 亚洲成人av一区 | 黄色一级大片 | 日本熟妇xxxx潮喷视频 | 男女做爰高清无遮挡免费视频 | 亚洲精品欧美综合一区二区 | 中文字幕一区二区三区不卡 | 伊人网伊人影院 | 麻豆国产精品va在线观看不卡 | 国产成人无码一区二区三区在线 | 欧美激情18p | 国产男生夜间福利免费网站 | 成人精品aaaa网站 | 国产成人精品日本亚洲直接 | 亚洲乱码国产乱码精品精在线网站 | 欧美成人秋霞久久aa片 | 毛片免费视频观看 | 国产福利小视频在线 | 亚洲一区中文字幕永久在线 | 亚洲国产成人精品激情在线 | 久青草国产97香蕉在线影院 | 欧美成人极品 | 裸体丰满白嫩大尺度尤物 | 亚洲色图欧美另类 | 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 | 羞羞视频网页 | 69av国产| 国内精品久久精品中文久久婷婷 | www.91av在线| 日韩伦人妻无码 | 欧洲极品少妇 | 亚洲国产欧美中文手机在线 | 国产欧美日韩综合在线成 | 国产suv精品一区二av18款 | 狠狠干网址 | 日本久久免费 | 99久久综合国产精品二区国产 | 亚洲激情av | 欧美韩中文精品有码视频在线 | 天天操网址 | 日本强伦姧熟睡人妻完整视频 | 黑白配国语在线播放免费 | 一本加勒比hezyo中文无码 | 欧美一二三区在线观看 | 又粗又硬又大又爽免费视频播放 | 国产精品白丝喷水在线观看 | 欧美生活一级片 | 国产在线视频一区 | 久久成年人 | 国产清纯白嫩初高生视频在线观看 | 久久精品色欧美aⅴ一区二区 | 国产三级短视频 | 中国国产免费毛卡片 | 亚洲国产精品成人精品无码区蜜臀 | 亚洲欧美动漫 | 美女吸乳羞羞视频网站 | 青青青国产最新视频在线观看 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 粉嫩虎白女p虎白女在线 | 色多多在线观看 | 台湾乡村少妇伦理 | 日韩欧美国产高清91 | 国产精品视频免费观看 | 国模冰莲自慰肥美胞极品人体图 | 亚洲精品无码av人在线观看国产 | 国产午夜不卡片免费视频 | 91精品国产综合久久婷婷香蕉 | 999久久久国产999久久久 | 国产视频二区三区 | 无人区国产成人久久三区 | 天堂一二三区 | 天天干视频 | 国产微拍精品一区二区 | 欧美成人午夜影院 | 久久99精品国产.久久久久 | 交换配乱吟粗大农村大坑性事视频 | 黄色大片av| 欧美激情在线免费观看 | 欧美福利网站 | 欧美aⅴ在线观看 | 中文字幕一区二区三区精品 | 久久精品99国产精品亚洲 | 国产精品亚洲一区二区在线观看 | 欧美日韩精品人妻狠狠躁免费视频 | 久久精品a亚洲国产v高清不卡 | 婷婷色亚洲 | 色网av | 久久精品入口九色 | 久久精品国内一区二区三区 | 特黄特色三级在线观看 | 亚洲欧美一区中文字幕蜜臀 | 亚洲激情国产 | 美女隐私视频黄www曰本 | 中国黄色毛片视频 | 国产男女做爰高清全过小说 | 欧美成aⅴ人高清ww 奴色虐av一区二区三区 | 777米奇影院狠狠色 国产精品一线二线三线 | 日本成片区免费久久 | 欧美在线视频精品 | 亚洲天堂自拍偷拍 | 狠狠操婷婷 | 91av在线免费观看 | 国产精品久久无码不卡黑寡妇 | 亚洲成人a∨| 久久久午夜爽爽一区二区三区三州 | 中文字幕精品无码综合网 | 人妻被按摩到潮喷中文不卡 | 免费看成人aa片无码视频羞羞网 | 欧美情侣性视频 | 无码人妻一区二区三区兔费 | 欧美丰满熟妇乱xxxxx图片 | 久久久久久久久久久久 | av九九 | 日韩高清不卡 | 天天躁日日躁狠狠躁精品推荐 | 国产成人精品福利网站 | 少妇与公做了夜伦理69 | 天堂资源地址在线 | av免费播放一区二区三区 | 女人高潮a毛片在线看 | 国产成人精彩在线视频 | 97人妻碰碰碰久久久久禁片 | 天天狠天天狠天天鲁 | 久久婷婷成人综合色综合 | 久久久精品视 | 日本免费网站视频 | 少妇被粗大的猛烈进出图片 | 午夜亚洲aⅴ无码高潮片苍井空 | 天摸夜夜添久久精品亚洲人成 | 亚洲夜射| 91超薄肉色丝袜交足高跟凉鞋 | 日韩网红少妇无码视频香港 | 色综合加勒比 | 国产成人av无码永久免费 | 一级做a免费 | 精品久久久久久综合 | 玩弄放荡人妻一区二区三区 | 亚洲宅男精品一区在线观看 | 久久中文字幕在线观看 | 免费精品99久久国产综合精品应用 | 日本道色综合久久影院 | 婷婷色人阁 | 无翼乌18禁全肉肉无遮挡彩色 | 日本永久免费啪啪网站 | 中产乱码中文在线观看免费软件 | 亚洲影视大全 | 国产又色又爽又黄 | 欧美日韩成人在线播放 | 亚洲色欲在线播放一区二区三区 | 男人亚洲天堂 | 成人看片黄a免费看在线 | 在线无码视频观看草草视频 | 免费全部高h视频无码软件 国产又黄又粗又猛又爽的视频 | 久久精品国产欧美日韩 | 久久精品国产99国产精品最新 | 男女无遮挡免费视频 | 操性感美女 | 成人午夜精品久久久久久久网站 | 97视频总站| 久久久久久九九精品久 | av片网| 麻豆果冻精东九一传媒mv | 日韩人妻无码精品系列专区 | 黑人又粗又大xxx精品 | 精品在线你懂的 | 91欧美激情一区二区三区 | 男人的天堂视频网站 | 欧美bbb | 国产超碰人人做人人爽av动图 | 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 麻豆国产尤物av尤物在线观看 | 一区二区成人在线 | 久女女热精品视频在线观看 | 99精品国产在热久久无毒 | 国产麻豆精品乱码一区 | 快播黄色片 | 国产精品人八做人人女人a级刘 | 久久大香国产成人av | 色呦呦网站入口 | 99久久久 | 欧美日韩在线播放 | 日韩av在线第一页 | 日本二区三区欧美亚洲国产 | 欧美精品 - 色网 | 欧美综合日韩 | 亚洲精品一区14p | 浮妇高潮喷白浆视频 | 久久久久国色a∨免费看 | 欧美丰满熟妇xxxx性 | 日韩成人免费在线视频 | 精品久久久中文字幕人妻 | 日韩欧美高清在线视频 | 午夜影院视频 | 中文字幕av高清 | 国产视频福利在线 | 久久久久88色偷偷 | 自拍偷拍av | 一区二区三区内射美女毛片 | 亚洲永久精品在线观看 | 在线一区二区欧美 | 黑人巨大xxxxx性猛交 | 在线观看www | 99国产精品久久久久久久久久久 | 国产精品亚洲精品久久 | 夜夜躁很很躁日日躁2020铜川 | 狠狠干2017| 青青青视频在线播放 | 国产粗语刺激对白性视频 | 中日韩毛片 | 亚洲色图另类小说 | 偷窥自拍亚洲色图 | 国产亚洲欧美视频 | 国产成人一区二区三区影院动漫 | 国产免费一区二区三区在线能观看 | 欧美福利视频在线 | 99久久精品国产第一页 | 欧美拍拍视频免费大全 | a级片一区 | 欧洲色影院 | 99re这里只有精品在线 | 精品伊人| 欧美日韩a√ | 日韩中文一区二区三区 | 国产精品亚洲片在线播放 | 午夜少妇久久久久久久久 | 欧美日韩国产免费观看 | 国产精品伦理久久久久 | 无码av中文字幕久久专区 | 麻豆国产va免费精品高清在线 | av网址在线看 | 日本天天操 | 极品少妇被弄得高潮不断 | 啪啪视屏 | 国产资源在线观看 | 午夜av免费 | 中文字幕免费高清在线观看 | 白嫩少妇抽搐高潮12p | 欧美黄色免费大片 | 亚洲自拍一区在线观看 | 无遮挡边摸边吃奶边做视频免费 | 99九九99九九九99九他书对 | 天天爱天天做久久狼狼 | 亚洲日本高清一区二区三区 | 九九热精品在线 | 日本少妇人妻xxxxx18 | 国产精品女同一区二区久久夜 | 中文字幕久久综合伊人 | 四虎国产精品永久一区高清 | 国内自拍视频一区二区三区 | 日日干夜夜艹 | 成人性生活毛片 | 天天都色| 免费国产一区二区三区 | 日韩三区在线 | 欧美孕妇变态孕交粗暴 | 久久无码中文字幕久久无码app | av免费在线观看网址 | 中文字幕av伊人av无码av狼人 | 欧美一级夜夜爽 | www.日日操 | 亚洲 成人 av | 久久只有这里有精品4 | 久久精品第九区免费观看 | 亚洲精品久久夜色撩人男男小说 | 国产精品视频一区二区亚瑟 | 成人免费无码视频在线网站 | 欧美激情免费在线 | 人妻与老人中文字幕 | 亚欧在线观看 | 野花在线无码视频在线播放 | 涩涩资源站 | 色婷婷亚洲婷婷八月中文字幕 | 国产欧色美视频综合二区 | 人妻无码人妻有码中文字幕在线 | 亚洲日韩在线中文字幕线路2区 | 激情综合网五月天 | 亲子乱对白乱都乱了视频 | 91二区| 免费网站内射红桃视频 | 96久久欧美麻豆网站 | 亚洲日本va午夜中文字幕一区 | 日韩一级片网址 | 亚洲巨乳自拍在线视频 | 精品美女一区二区三区 | 欧美性生活免费 | 国产精品美女www爽爽爽视频 | 三上悠亚精品一区二区久久 | 欧美精品久久久久久久久免 | 羞羞视频免费在线看 | 久久精品国产一区二区三区 | 国产视频在线免费 | 国产成人av免费网址 | 古典武侠av| 玩中年熟妇让你爽视频 | 日韩中文字幕不卡 | 北条麻妃在线一区二区三区 | 国产成人亚洲日韩欧美性 | 97无码免费人妻超级碰碰夜夜 | 久草视频中文在线 | 色欲人妻aaaaaaa无码 | 东北少妇不戴套对白第一次 | 色婷婷一区二区三区av免费看 | 国产又大又黄 | 韩国黄色片网站 | 国产乱xxxxx97国语对白 | 高清日韩av | 国产美女被遭强高潮免费一视频 | 中文天堂在线资源www | 久久久久伊人 | 最新日韩在线 | 一区二区在线免费播放 | 嫩草视频入口 | 久草热在线 | 一区二区不卡在线 | 天天躁夜夜躁狠狠综合 | 热99re久久精品这里都是精品 | 动漫美女羞羞视频网站中文 | 开心激情综合 | 毛片大全免费观看 | 亚洲精品无码永久电影在线 | 成熟丰满熟妇高潮xxxxx | 天天舔夜夜操 | 中文字幕av一区 | av在线男人天堂 | 国产揄拍国产精品人妻蜜 | 特级黄色一级片 | 怡红院精品久久久久久久高清 | 欧美情趣视频 | 成人午夜精品视频 | 亚洲第一极品精品无码久久 | 青青草原综合久久大伊人 | 免费看欧美一级特黄a大片 一区二区三区美女 | 朝桐光一区 | 国产精品igao视频网 | 日本免费www | 欧美极品jizzhd欧美爆 | 好黄好硬好爽免费视频一 | 久久久亚洲精品一区二区三区 | 97香蕉久久夜色精品国产 | av在线看片 | 久久免费手机视频 | 在线观看aaa | 天天在线观看 | 日韩特黄一级欧美毛片特黄 | 狠狠躁夜夜躁人人爽超碰97香蕉 | 日木强大喷奶水av片 | 99草在线视频 | 一区二区高清视频 | 欧美成人亚洲高清在线观看 | 欧美日本免费 | 男女插插动态图 | 欧美日韩一区视频 | 国产一级特黄aaa大片 | 国产精品福利视频一区 | 欧美一区二区三区日韩 | 欧美老熟 | 色噜噜狠狠色综合欧洲 | 日本三级香港三级人妇三 | 久热精品视频天堂在线视频 | 亚洲人成人网站18禁 | 在线观看免费人成视频色 | 在线观看肉片av网站免费 | 天天干,天天操,天天射 | 丁香五精品蜜臀久久久久99网站 | 91精品国产综合久久精品性色 | 国产黄大片在线观看 | 国产99久久九九精品无码 | 日日夜夜爽爽 | 午夜精品久久久久成人 | 97精品国产aⅴ | 欧美精品video | 久久免费视频7 | 欧美一乱一交一性ed2k | 国产午夜福利内射青草 | 欧洲女同互摸互添 | 竹内纱里奈69av在线 | 成人乱人乱一区二区三区软件 | 国产精品久久久久久久久鸭无码 | 人人做人人妻人人精 | 国产黄大片在线观看 | 99视频免费观看 | 国产精品v欧美精品∨日韩 天天躁日日躁狠狠躁喷水软件 | 久久亚洲精精品中文字幕早川悠里 | 亚洲国产精品久久久久久久久久久 | 玖玖爱这里只有精品 | 自拍偷区亚洲综合12p | 91久久精品美女高潮 | 暴力强奷在线播放无码 | 国产一区视频在线免费观看 | 国产野外作爱视频播放 | 极品粉嫩国产48尤物在线播放 | 粉嫩粉嫩的18在线观看 | 成人18禁深夜福利网站app免费 | 亚洲一区激情校园小说 | 中文字幕在线人 | 伊伊亚洲综合人网777 | 国产美女视频免费观看的网站 | 成人免费黄色小视频 | 日韩精品在线免费视频 | 亚洲高清国产av拍精品青青草原 | 亚洲日本va午夜在线影院 | 国产精品久久久久久久久免费桃花 | 91国产丝袜脚调教 | 青青青国产在线视频在线观看 | 国产成人在线免费观看 | 永久免费观看的毛片手机视频 | 人妻无码手机在线中文 | 好大好深好猛好爽视频拍拍拍 | 亚洲区小说区激情区图片区 | 精品丝袜国产自在线拍小草 | 久草成人在线视频 | 深夜福利看片 | 干欧美少妇 | 成人av一区二区亚洲精 | 日本三级韩国三级欧美三级 | 欧美12--15处交性娇小 | 亚州精品av久久久久久久影院 | 夜色爽爽影院18禁妓女影院 | 日韩99在线 | 中文 | 亚洲欧美高清一区二区三区 | 亚洲色无码一区二区三区 | 国产av午夜精品一区二区三区 | 疯狂三人交性欧美 | 人久久精品中文字幕无码小明47 | 曰韩人妻无码一区二区三区综合部 | 色鬼久久综合 | 免费国产人成18在线观看 | 免费的一级黄色片 | 亚洲精品电影院 | 色综合一区 | 久久精品aⅴ无码中文字字幕蜜桃 | 久久亚洲中文字幕无码 | 国产成人无码牲交免费视频 | 丰满大乳一级淫片免费播放 | 久久天| 99精品国产综合久久久久五月天 | 国产a大片免费 | 在线天堂中文最新版www | 亚洲—本道 在线无码av发 | 亚洲高清国产拍精品闺蜜合租 | 肉欲性毛片交38 | 精品久久久无码中文字幕 | 天堂va在线 | 中文字幕韩日 | 久久精品国产999久久久 | 国产开嫩苞实拍在线播放视频 | 香蕉97视频观看在线观看 | 日韩新无码精品毛片 | 噜噜吧噜噜色 | 西欧free性满足hd老熟妇 | 中文字幕有码在线播放 | 成 人 黄 色视频免费播放 | 色吧婷婷| 二区三区四区视频 | 超碰精品在线观看 | 国产熟妇人妻精品一区二区动漫 | 久久 国产 尿 小便 嘘嘘 | 日本一区二区三区免费软件 | 久久精品女人天堂av免费观看 | 一级视频在线观看 | 日韩av男人的天堂 | 性饥渴少妇av无码毛片 | www.色偷偷.com | 午夜无码乱码在线观看 | 国内精品免费久久久久软件 | 国产第六页 | 粉嫩av一区二区三区免费野 | 中国白嫩的18sex少妇hd | 亚洲一区二区视频在线 | 亚洲欧美日韩国产另类电影 | 欧美色成人综合影院 | 久久久精品妓女影院妓女网 | 伊人久久久久久久久久久 | 国产看黄网站 | 中文字幕无码精品亚洲资源网 | 国产成人无码a区视频在线观看 | 人妻巨大乳挤奶水hd免费看 | 久久婷婷香蕉热狠狠综合 | 国产精品免费一区二区区 | 久久综合色一综合色88欧美 | av超碰| 西西人体自慰扒开下部93 | 亚洲香蕉 | 久久不见久久见www免费 | 国产国产成人久久精品 | 亚洲 日韩 欧美 成人 在线 | 国产成人一区二区三区别 | 麻豆乱淫一区二区 | 亚洲国产成人精品久久久 | 国产精品青草久久福利不卡 | 99re8这里有精品热视频 | 尤物国产在线精品一区 | 亚洲精品在线观看网站 | 在线天堂资源www在线污 | 欧美日韩国产第一区 | www.五月天..com | 亚洲网站视频 | 欧美影院a∨天堂 | 欧美自拍三级 | 人妻丝袜中文无码av影音先锋 | 亚洲第一se情网站 | 最新亚洲人成无码网站 | 亚洲精品揄拍自拍首页一 | 日本精品一区二区三区视频 | 一级又爽又黄的免费毛片视频 | 午夜无码区在线观看 | 婷婷精品在线 | 欧美成人伊人久久综合网 | 亚洲一卡二卡三卡 | 99热在线播放 | 天堂8在线最新版在线 | 制服丝袜中文字幕在线 | 亚洲真人无码永久在线观看 | 97无码免费人妻超级碰碰碰碰 | 亚洲人成网线在线播放va蜜芽 | 国产亚洲一本大道中文在线 | 国产a精品 | 极品少妇被黑人白浆直流 | 欧美男女激情 | 亚洲春色av无码专区在线播放 | 国产精品久久久久久久久久红粉 | 波多野结衣一区二区三区高清av | 亚洲一本大道av久在线播放 | 亚洲精品一区二区在线观看 | 欧美mv日韩mv国产mv网站 | 亚洲精品国产偷自在线观看 | 爱逼综合网 | 正在播放强揉爆乳女教师 | 国产免费无码av片在线观看不卡 | 国产亚洲va综合人人澡精品 | 日韩三级视频在线观看 | 天天干天天干天天干天天干天天干 | 欧美老熟 | 日本三级韩国三级在线观看 | 国产私拍大尺度在线视频 | 影音先锋女人av鲁色资源网久久 | 欧美一级免费看 | av黄色国产 | 亚洲欧美日韩国产成人一区 | 日本aa在线观看 | 欧美黑人性猛交xxxx免费动漫 | 久久中文一区二区 | 青青草狠狠操 | 夜夜夜夜猛噜噜噜噜噜试看 | 少妇高潮惨叫久久久久电影 | 日韩在线视频中文字幕 | 亚洲精品第一区二区三区 | 亚洲国产欧美在线人成 | 伊人久久大香线蕉avapp下载 | 国产精品久久久久久中文字 | 成人福利一区 | 激情视频区 | 在线观看免费播放av片 | 亚洲色婷婷综合久久 | 亚洲日韩欧美国产高清αv 欧美成人一区在线 | 黄色激情网站在线观看 | 国产精品国产对白熟妇 | 中文字幕av一区二区三区 | 国内精品自线一区二区三区 | 成年人免费av | 又色又爽又黄的美女裸体网站 | 亚洲在av极品无码天堂手机版 | 天天插天天摸 | 麻豆国产丝袜白领秘书在线观看 | 亚洲精品国偷拍自产在线观看 | 91欧美精品成人综合在线观看 | 国产精品久久久久毛片软件 | 久9热视频这里只精品18 | 美女被啪到深处抽搐视频 | 国产色视频免费 | 亚洲国产精品成人综合在线 | 亚洲午夜精品在线观看 | 亚洲欧美韩日 | 国产又粗又硬又长又爽视频 | 一本大道综合伊人精品热热 | 亚洲综合色丁香婷婷六月图片 | 国产成人人综合亚洲欧美丁香花 | 波多野结衣av在线播放 | 国精品无码一区二区三区左线 | 手机av在线网站 | 天堂√最新版中文在线天堂 | 亚洲色婷六月丁香在线视频 | 欧女人精69xxxxxx | 亚洲国产成人精品无码一区二区 | 亚洲男人电影天堂无码 | 国产在线精品一区二区不卡麻豆 | 久久精品手机观看 | 亚洲另类激情综合偷自拍图片 | 精品久久网站 | 日韩国产精品人妻无码久久久 | 亚洲国产欧美日韩欧美特级 | www.亚洲一区二区三区 | 激情超碰在线 | 久久亚洲国产精品 | 国产18videosex国产 | 国产精品美女www爽爽爽 | 狠狠干夜夜草 | 国产精品无码无卡在线观看久 | 911香蕉视频 | 国产成人精品综合在线观看 | 久久久久欧美国产高潮 | 少妇做爰免费视频网站色黄 | 在线播放91 | 尤物国产精品 | 亚洲欧美日韩视频高清专区 | 久久久久久视 | 成人伊人| 中文字幕v亚洲日本在线电影 | 男女无遮挡毛片视频免费 | 中国极品少妇xxxx做受 | 妇女伦子伦视频高清在线 | 欧美最新精品videossexohd | 日韩欧美偷拍高跟鞋精品一区 | 亚洲成a人v欧美综合天堂下载 | 天天做天天爱天天操 | 国产伦理五月av一区二区 | 丁香婷婷激情俺也去俺来也 | 亚洲欧美日韩国产精品b站在线看 | 亚洲色偷拍另类无码专区 | 亚洲视频网站在线观看 | 极品嫩模高潮叫床 | 揉搓凸起的花蒂爽尿在线观看 | 最新日本一道免费一区二区 | 无码av人片在线观看天堂 | 在线视频免费播放 | 91精品国产免费 | 在线理论视频 | 亚洲一区二区三区av激情 | 摸丰满大乳奶水www免费 | 欧美激情15p | 图片区小说区另类春色 | а√天堂资源国产精品 | 香蕉福利影院 | 黑人强伦姧人妻日韩那庞大的 | 国内野外强奷在线视频 | 好男人在在线社区www在线影院 | 日韩中文字幕影院 | 男男车车的车车网站w98免费 | 与子敌伦刺激对白播放 | 国产精品视频一区二区三区 | 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠片 | 枫花恋在线观看 | 中文字幕日日夜夜 | 亚洲精品无圣光一区二区 | 欧美亚洲国产成人一区二区三区 | 国内揄拍国内精品少妇国语 | 日日澡夜夜澡人人高潮 | 男女性杂交内射妇女bbwxz | 99在线精品免费视频 | 美女自卫慰黄网站免费 | 久久zyz资源站无码中文动漫 | 国产毛片毛片毛片毛片 | 亚洲成人一区在线 | 日韩理论视频 | 超碰欧美 | 一本加勒比hezyo无码专区 | 久久婷婷成人 | 日日综合 | 亚洲色图欧美另类 | 久久精品中文字幕一区 | 伊人日韩| 与黑人高h系列 | 国产精品午夜无码av天美传媒 | 欧美日韩精品一区二区在线视频 | 亚洲成人婷婷 | 福利所第一福利 | 亚洲天堂伊人网 | 亚洲欧洲日产国码中文字幕 | 日本在线观看网站 | 黑人ⅴvideo暴力亚洲娇小 | 成年人看的毛片 | 蜜臀999| 五月天狠狠操 | 国产黄 | 性欧美bbw | 国产成人无码综合亚洲日韩 | 性人久久久久 | 国产精品a免费一区久久电影 | 成人三级无码视频在线观看 | 波多野结衣亚洲视频 | 精品国产免费一区二区三区 | 日韩欧美国产综合 | 亚洲精品乱码久久久久久久久久久久 | 91视频在线观看视频 | 久久这里只有 | 婷婷综合一区 | 91精品啪在线观看国产手机 | www.youjizz.com视频| 久草热久草视频 | 中文字幕人成乱码熟女香港 | 超碰人人草人人干 | 日本免费一区二区三区最新vr | 国内野外强奷在线视频 | 欧美成人精品欧美一级 | 看国产一级片 | 成人福利视频在线观看 | 91欧美精品午夜性色福利在线 | 中文字幕在线精品中文字幕导入 | 成人看的羞羞视频免费观看 | 香港三级日本三级韩级人妇 | 亚洲最新中文字幕成人 | 日韩精品一区二区三区丰满 | 五月av | 黄视频网站在线看 | 国产亚洲精品自在久久 | 亚洲国产高清在线一区二区三区 | 欧美喷潮久久久xxxxx | 国产精品一区二区人人爽 | 影音先锋亚洲成aⅴ无码 | 久久老鸭窝 | 中日韩一线二线三线视频 | 久久麻豆成人精品av | 亚洲高清最新av网站 | 欧美高清熟妇啪啪内射不卡自拍 | 无码人妻丰满熟妇区五十路在线 | 日本一区二区在线不卡 | 国产乱人伦av在线a 亚洲色欲色欲综合网站sw0060 | 欧美视频在线播放 | 欧美黑人做爰爽爽爽 | 久久国产乱子伦精品免费午夜,浪货好紧 | 中文字幕视频免费 | 午夜寂寞影视 | 国产老头视频 | 中国精品偷拍区偷拍无码 | 日韩欧美亚洲综合久久影院 | jizz美女 | 久久久亚洲国产天美传媒修理工 | 国产成人精品福利一区二区三区 | 18禁超污无遮挡无码网址极速 | 欧美日韩成人一区 | 欧洲美女黑人粗性暴交 | 12萝自慰喷水亚洲网站 | 亚洲 春色 另类 小说 | 亚洲一区二区无码偷拍 | 毛片24种姿势无遮无拦 | 欧美性高潮 | 精品久久久久久亚洲综合网站 | 14美女爱做视频免费 | 少妇被粗大的猛烈进出动视频 | 少妇精品视频无码专区 | 青青青爽在线视频免费观看 | 97视频人人| 日韩欧美自拍 | 少妇bbr搡bbb搡bbb | 国产精品国产三级国产av麻豆 | 国产精品床戏女高潮原声 | 五月激情婷婷在线 | 日本免费视频观看 | 亚洲国产精品国自产拍av | 成人午夜福利视频后入 | 免费人成视网站在线不卡 | 久久久久久久久久久久网站 | 人妻少妇乱子伦精品无码专区电影 | 伊人永久 | 国产精品96久久久久久吹潮 | 男人撒尿视频免费网站 | 国产无遮挡又黄又爽免费网站 | 欧美 亚洲 视频 | 天天综合在线观看 | 精品无人乱码一区二区三区 | 亚洲人成网站18禁止大 | 亚洲狠狠爱综合影院网页 | 亚洲国产成人va在线观看 | 日韩精品 中文字幕 视频在线 | 亚洲第一天堂久久 | 国产不卡一区 | 嫩草影视| 久久免费在线观看 | avtt香蕉久久 | 青青青草国产线观 | 欧美成人一区二区三区高清 | 日本三级欧美三级人妇视频 | 中文字幕av一区二区 | 亚洲 另类 在线 欧美 制服 | 国产天堂av| 午夜性福利 | 美女露隐私免费视频网站 | 国产边摸边吃奶边做爽视频 | 国产精品福利免费 | 视频区 国产 图片区 小说区 | 国产精品视频黄色 | 成人乱人乱一区二区三区 | 欧美日本一区二区视频在线观看 | 国产69精品久久久久久久久久 | 999精品视频在线 | 日本特黄特色大片免费视频老年人 | 国产成人一区二区三区在线播放 | 亚洲高清一区二区三区不卡 | 久久精品国产一区二区三区不卡 | 激情偷乱人伦小说视频 | 国产精品99精品无码视亚 | 欧美精品一区在线播放 | 四川女人高潮毛片 | 男女爽爽午夜18禁影院免费 | 日日草夜夜草 | www.看毛片 | 亚洲一区国产视频 | 午夜免费1000 | 精品人妻少妇一区二区三区在线 | 久久午夜夜伦鲁鲁片无码免费 | 激情综合小说 | 国产女主播喷水视频在线观看 | 偷av色偷偷男人的天堂 | 免费大片av手机看片高清 | 侵犯人妻女教师中文字幕 | 亚洲精品毛片av一区二区三区 | 中文字幕无码一区二区免费 | 亚洲人色婷婷成人网站在线观看 | 免费看一级视频 | 卡一1卡2卡三卡4卡精品网站 | 日韩精品免费看 | 日本精品一区二区三区四区 | 牛牛影视精品一区二区在线看 | 亚洲日韩中文字幕在线播放 | 四虎免费在线 | 久久999精品久久久 日本一卡精品视频免费 | 日韩av大片在线观看 | 日本在线播放 | 成人国产精品色哟哟 | 天天操天天做 | 久久精品人人做人人综合试看 | 亚洲小说区图片区都市 | 中文字幕国产日韩 | 黄色片在线 | 国产精久久一区二区三区 | 久久久无码精品亚洲日韩精东传媒 | 日本大片免a费观看视频 | 亚洲骚图| 国语自产拍在线视频中文 | 91香蕉视频 | 丰满的岳乱妇一区二区三区 | 最新精品久久 | 自拍偷自拍亚洲精品第1页 日韩精品视频在线免费观看 | 插插亚洲 | 欧美日韩亚洲精品瑜伽裤 | 小荡货好紧好爽奶头大视频 | 亚洲专区在线视频 | 国产精品国产三级国产专区53 | 少妇人妻在线无码天堂视频网 | 久久视频在线观看免费 | 成人午夜免费视频 | 国产www在线观看 | 人妻人人做人碰人人添青青 | 国产精品人人爽人人做我的可爱 | 日韩福利一区二区三区 | 亚洲精品久久久久玩吗 | 久久久久久国产精品999 | 国产在线一区二区三区四区五区 | 成人影院www蜜桃网站 | 免费无遮挡在线观看视频网站 | 91官网视频 | 成人免费无码精品国产电影 | 欧美国产日韩在线观看 | 亚洲中文字幕无码专区 | 伊人久久大香线蕉av网站 | 免费无码一区二区三区a片 久久精品道一区二区三区 26uuu另类亚洲欧美日本 | 亚洲美女福利视频 | 免费无码av片流白浆在线观看 | 中文字幕乱人伦视频在线 | 九九热久久这里只有精品 | 2020精品国产自在现线官网 | 欧美在线视频第一页 | 国产免费午夜福利757 | 欧美老女人性视频 | 亚洲精品一区二区三区大桥未久 | 精品国产一区二区三区四区阿崩 | 中文无码日韩欧 | 999这里只有是极品 九九久久精品国产免费看小说 | 亚洲欧洲国产综合aⅴ无码 自拍视频第一页 | 国产草草影院ccyycom | 永久91嫩草亚洲精品人人 | 欧美一区二区三区婷婷月色 | 成人羞羞国产免费软件小说 | 欧美又粗又深又猛又爽啪啪 | 日日摸夜夜夜夜夜添 | 在线免费精品 | 久久视频在线观看免费 | 国产一区二区福利 | 18禁网站免费无遮挡无码中文 | 19+韩国美女vip福利 | 免费国产黄网站在线观看可以下载 | 国产成人精品无码片区在线观看 | 天天爱天天做久久狠狠做 | aa级黄色片 | 四虎影视在线 | 无码人妻aⅴ一区 二区 三区 | 在线精品免费视频无码的 | 极品福利在线 | 成人午夜影院 | 国产一伦一伦一伦 | www.youjizz.com日本 | 大肉大捧一进一出好爽视频mba | 国产在线精品91国自产拍免费 | 伊人色综合一区二区三区影院视频 | 久久久国产99久久国产久麻豆 | 亚洲爆乳成av人在线视菜奈实 | 99久久国产露脸精品国产麻豆 | 国产成+人+综合+亚洲专区 | 少妇高潮毛片色欲ava片 | 欧美最新精品videossexohd | 97香蕉碰碰人妻国产欧美 | 亚洲欧洲日本一区二区三区 | 久久精品无码午夜福利理论片 | 免费99视频 | 2021少妇久久久久久久久久 | 亚洲精品久久久久久蜜桃 | 国产av中文av无码av狼人 | 欧美大荫蒂xxx | 加勒比色综合久久久久久久久 | 2018av天堂在线视频精品观看 | 无码小电影在线观看网站免费 | 韩国无码av片在线观看网站 | 亚洲人成网77777色在线播放 | 五月婷婷丁香在线 | 在线a久青草视频在线观看 成午夜精品一区二区三区软件 | 91久久婷婷| 热99re久久国超精品首页 | 欧美大片在线观看 | 人妻无码全彩里番acg视频 | jizzjizz亚洲中国少妇 | 免费无码黄十八禁网站在线观看 | 国产成人麻豆精品午夜在线 | 曰韩内射六十七十老熟女影视 | 超碰毛片 | 久久99精品久久久久久hb无码 | 伊人久久青青 | 中文字幕一本久久综合 | 国外国内精品国产成人国产三级 | 91成人xxx| 男人女人午夜视频免费 | 高潮抽搐潮喷毛片在线播放 | 懂色中文一区二区在线播放 | 成人无码视频在线观看网址 | 色一情一乱一伦一区二区三区四区 | 爱情岛论坛一区二区 | 欧美v亚洲v日韩v最新在线 | 亚洲精品视频免费看 | 国产成人精品免费午夜app | 午夜精品一区二区三区av | 日本欧美久久久免费播放网 | 国产乱乱 | 又色又爽又黄无遮挡的免费视频 | 亚洲国产精品成人天堂 | 美女国产精品视频 | 婷婷中文在线 | 亚洲中文无码av永久不收费 | 国产伦久视频免费观看视频 | 无码人妻丰满熟妇区五十路在线 | 国产初高中生视频在线观看 | 亚洲国产欧美日韩在线 | 亚洲色精品三区二区一区 | 亚洲欲色欲色xxxxx在线 | 久久久久久综合网 | 天天操天天射天天添 | 中文字幕日韩欧美 | 狠狠躁夜夜躁久久躁别揉 | 蜜柚av久久久久久久 | 日本特黄特黄刺激大片 | 亚洲狼人精品一区二区三区 | 日日干日日摸 | 国产高清乱码女大生av | 三级国产国语三级在线 | 午夜视频在线 | 啊~我是sao货快cao我视频 | 色碰 | 日韩视频精品在线 | 强被迫伦姧高潮无码bd电影 | 性无码一区二区三区在线观看 | 激情偷乱人伦小说视频在线 | 成人美女视频在线观看 | 中文字幕1区2区 | 91视频免费观看在线看 | 国产精品福利久久久 | 亚洲 日韩 国产欧美 另类 | 免费一级欧美 | 欧美一级性视频 | 亚洲成a∨人片在无码2023 | jizz成熟丰满中文字幕.麻豆 | 国内毛片精品av一二三 | 中文字幕无线观看不卡网站 | 中文字幕无码日韩av | 日韩av无码久久精品免费 | 偷看美女洗澡一二三四区 | 国产超碰人人爽人人做av | 7777欧美成是人在线观看 | 国产精品免费福利久久 | 黄色av网站免费在线观看 | 国产精品视频一区二区三区无码 | 欧美浓毛大泬视频 | 一本精品99久久精品77 | 永久免费网站在线 | 亚洲精品久久国产片400部 | 欧美日韩性生活视频 | 无码不卡黑人与日本人 | 国产精品一品二区三区的使用体验 | 国产98涩在线 | 欧洲 | 强制中出し~大桥未久在线播放 | 亚洲综合色在线 | 浪潮av激情高潮国产精品 | 国产99视频在线观看 | 国产亚洲日韩av在线播放不卡 | 人妻三级日本三级日本三级极 | 性色av一区二区三区咪爱四虎 | 加勒比久久综合网天天 | 精品国精品自拍自在线 | 人人添人人妻人人爽夜欢视av | 免费国产污网站在线观看 | 国产办公室无码视频在线观看 | 国产欧美精品一区aⅴ影院 国产午夜精品av一区二区麻豆 | 亚洲国产精品视频在线 | 国产剧情av麻豆香蕉精品 | 国产人妻无码一区二区三区免费 | 无码人妻丝袜在线视频 | 91免费大片网站 | 97精品久久久大香线焦 | 另类专区亚洲 | 国产精品无码免费视频二三区 | 毛片免费视频肛交颜射免费视频 | 亚洲综合色区另类av | 伊人色综合一区二区三区影院视频 | av天堂亚洲区无码先锋影音 | 日韩视频在线观看免费 | 亚洲中文字幕日产无码2020 | 黄色一级大片在线观看 | 国模冰冰炮一区二区 | 男女性高潮免费网站 | 久久porn | 国产成人亚洲日韩欧美 | 久久中文字幕人妻av熟女 | www.日韩欧美 | 久久久久高潮综合影院 | 精品国产美女福到在线不卡 | 久久天天躁夜夜躁狠狠85台湾 | 亚洲中文字幕无码永久在线不卡 | 亚洲精品第一国产综合野草社区 | 强开小婷嫩苞又嫩又紧视频韩国 | 四虎久久久 | 强侵犯の奶水授乳羞羞漫虐 | 久久婷婷国产剧情内射白浆 | 欧美一区二区三区精品免费 | 警花系列乱肉辣文小说 | 99re8在线精品视频免费播放 | 中文字幕成熟丰满人妻 | 国产视频手机在线播放 | 都市激情国产 | 亚洲激情视频网站 | 日韩在线网址 | 中文字幕日韩精品亚洲一区小树林 | 男女高潮又爽又黄又无遮挡 | 亚洲人成网站在线观看69影院 | 亚洲欧美国产高清va在线播放 | 天天射天天日本一道 | 欧美亚洲国产一区 | 国产精品一区二区久久精品爱微奶 | 日韩国产在线播放 | 国产精品乱码一区二三区小蝌蚪 | 一区二区视频 | 亚洲精品一区二区三区精华液 | 精品国产av一区二区果冻传媒 | 国产亚州精品女人久久久久久 | 97人洗澡人人澡人人爽人人模 | 最新免费黄色 | 欧美最骚最疯日b视频观看 大杳蕉狼人伊人 | 无码专区 人妻系列 在线 | 人人添人人爽 | 久久一本加勒比波多野结衣 | 日本人dh亚洲人ⅹxx | 97久久久亚洲综合久久 | 国产成人精品av久久 | 青草青草 | 国内成人免费视频 | 蜜臀久久99精品久久久无需会员 | 国产精品极品美女自在线观看免费 | 欧乱色国产精品兔费视频 | 最新日韩精品中文字幕 | 免费看片啪啪tv | 日韩在线高清 | 操老女人逼视频 | 欧美八区 | 中文字幕成人在线视频 | 800av在线播放 | 日日摸夜夜骑 | 少妇特黄a一区二区三区 | 色综合天天视频在线观看 | 青娱乐在线视频免费观看 | 精品久久久久久久久午夜福利 | 欧美激情一区二区三区aa片 | 绝密卧底柳云龙45集播放地址 | 久久影视中文字幕 | 西西人体44www高清大胆 | 性欧美乱束缚xxxx白浆 | 少妇精品无码一区二区免费视频 | 美女视频网站免费 | 成人免费网站视频www | 丰满诱人的人妻3 | 亚洲中文字幕国产综合 | 涩涩视频软件 | 亚洲乱码国产乱码精品精在线网站 | 午夜福利精品导航凹凸 | 久草精品视频在线观看 | 中文av无码人妻一区二区三区 | 肉丝av| 天堂av手机在线观看 | 久久无码中文字幕东京热 | 亚洲婷婷六月的婷婷 | 日本无码人妻一区二区色欲 | 中文字幕无线观看不卡网站 | 成年女人色毛片 | 欧美丝袜一区二区三区 | 天天做天天爱夜夜夜爽毛片 | 青青草无码伊人久久 | 艳妇荡女欲乱双飞两中年熟妇 | 男人天堂视频网 | 国产98涩在线 | 欧洲 | 成年午夜无码av片在线观看 | 国产黄色大片网站 | vr成人啪啪影视 | 人妻丰满熟妇av无码区hd | 91黄色小视频 | 久久国产精品视频一区 | 国产精品久久久久久久久久久久久久久久 | 日韩一区国产二区欧美三区 | 国产精品一区二区av麻豆 | 成人免费av在线 | 天天色综合色 | 草草福利影院 | 午夜婷婷网 | 亚洲精品一品区二品区三品区 | 深夜国产一区二区三区在线看 | 老熟女强人国产在线播放 | 我要看免费的毛片 | 成人性调教91 | 一二三四社区在线中文视频 | 极品探花在线播放 | 一本无码久本草在线中文字幕dvd | 久草热久草在线 | 国产激情小说 | 亚洲小说另类 | 国产麻豆精品乱码一区 | 久久精品日产第一区二区 | 国产欧美激情日韩成人三区 | 欧美成人午夜视频 | 久久久免费高清视频 | 麻豆亚洲国产成人精品无码区 | 成人精品一区二区三区电影 | 在线毛片网 | 日本最新免费二区三区 | 国产精品久久久久久av | 国产精品普通话国语对白露脸 | 精品无码av一区二区三区不卡 | 国内精品久久久久久久日韩 | 成人亚洲网站 | 乱码精品一卡2卡二卡三 | 99久久99久久久精品齐齐综合色圆 | 欧美性暴力变态xxxx | 上原瑞穗av在线播放 | 狠狠爱夜夜 | 国产性一乱一性一伧一色 | 丰满少妇被猛烈进入无码 | 亚洲国产av无码精品色午夜 | 久久草视频 | www.精品在线 | 亚欧在线免费观看 | 美女黄色毛片视频 | 精品无码国产日韩制服丝袜 | 综合久久久久久久久 | 久久久久亚洲精品 | 一道本在线伊人蕉无码 | 上司侵犯下属人妻中文字幕 | 真人无码作爱免费视频 | 91麻豆精品一二三区在线 | 亚洲精品国产精华液 | 亚洲综合另类小说专区 | 国产男女乱淫真高清视频免费 | 91久久精品日日躁夜夜躁国产 | 丰满放荡岳乱妇69www | 性大毛片视频 | 日本二区三区欧美亚洲国 | 午夜精品一区二区三区在线 | 亚洲精品一区国产精品 | 草逼导航 | 无码网站天天爽免费看视频 | 成人免费看片在线观看 | 亚洲一级毛片免费看 | 偷欧洲亚洲另类图片av天堂 | av午夜激情| 久久久噜噜噜久久熟女aa片 | cao死你小sao货湿透了学长 | 免费九九视频 | 中文字幕网伦射乱中文 | 九九久久视频 | 天堂а√在线最新版中文 | av在线免费网址 | 日韩国产一区二区 | 亚洲一区在线免费观看 | 国内av一区二区 | 免费人成年激情视频在线观看 | 91成人海角社区 | 亚洲国产一区视频 | 亚洲精品乱码久久久久久久久久久久 | 撕开奶罩揉吮奶头视频 | 国产成人精品三级麻豆 | 国产婷婷丁香五月缴情成人网 | 欧美人善z0zo性伦交 | 成人在线天堂 | 一本一道久久a久久精品综合蜜臀 | 疯狂添女人下部视频免费 | 国产成人福利视频 | 午夜福利院电影 | 亚洲精品网站在线观看 | 欧美第3页| 亚洲a∨精品无码一区二区 亚洲精品亚洲人成在线观看麻豆 | 久久综合网欧美色妞网 | 国产精品久久久av | 日韩国产成人在线 | 亚洲成人在线视频观看 | 日韩国产亚洲一区二区三区 | 日韩精品观看 | 美女扒开屁股让男人桶 | 男女激情网站 | 九九热爱视频精品 | 丰满人妻精品国产99aⅴ | 亚洲成人aaa | 人妻熟女久久久久久久 | 香蕉在线精品视频在线 | 成人国产精品久久久 | 人人91 | 日韩视频中文字幕精品偷拍 | 精品一区二区三区国产在线观看 | 欧美在线一二三区 | 国产中文字幕在线播放 | 伊人色综合影院 | 亚洲精品国男人在线视频 | 香蕉视频国产精品 | 成人中文字幕+乱码+中文字幕 | 天天操天天拍 | 国产精品午夜免费福利视频 | 午夜福利理论片高清在线观看 | 成人精品视频一区二区三区尤物 | 米奇777超碰欧美日韩亚洲 | 日本少妇人妻xxxxx18免费 | 国产人妻久久精品一区二区三区 | 在线天堂网 | 国产无遮挡a片又黄又爽漫画 | 操操干 | 欧美日韩视频在线第一区 | 少妇人妻偷人精品视频1出轨 | 四虎永久在线精品国产馆v视影院 | 久久精品国产99国产精品澳门 | 欧美人与动牲交zooz男人 | 人人射影院 | 男女午夜猛烈啪啦啦视频 | 免费男人下部进女人下部视频 | 精品国产一二三产品价格 | 精品无码一区二区三区爱欲九九 | 日日摸夜夜添夜夜添无码免费视频 | 老熟妇乱子伦牲交视频欧美 | 久久久久久中文字幕有精品 | 欧美激情精品久久久久久免费 | 日本一丰满一bbw | 小早川怜子痴女在线精品视频 | 强奷乱码中文字幕熟女一 | 亚洲欧美色图小说 | 亚洲激情视频一区 | 99热国产精品 | 色欲人妻aaaaaaa无码 | 亚洲精品一品区二品区三区 | 亚洲欧美韩日 | 福利片在线看 | 野花社区www视频最新资源 | 超碰在线超碰在线 | 性欧美大胆免费播放 | 精品精品国产欧美在线小说区 | 中文在线天堂资源 | 色综合网天天综合色中文 | 国语做受对白xxxxx在线 | 日日夜夜伊人 | 免费大片av手机看片不卡 | 免费看黄网站在线 | 久久亚洲欧美国产精品乐播 | 伊人依成久久人综合网 | 精品午夜久久福利大片 | aaaaa少妇高潮大片 | 星空大象mv高清在线观看免费 | 人妻熟妇乱又伦精品视频 | 日韩美女在线观看一区 | 国产系列丝袜熟女精品视频 | 欧美丰满大爆乳波霸奶水多 | 爱情岛亚洲论坛入口福利 | 初尝黑人巨炮波多野结衣183 | 熟女人妇 成熟妇女系列视频 | 欧美无乱码久久久免费午夜一区 | 亚洲国产精品天堂 | 国产女人高潮抽搐喷水免费视频 | av影院在线 | 美丽人妻系列无码专区 | jlzzjlzz国产精品久久 | 一区二区三区日韩视频在线观看 | 国产成人亚洲日韩欧美久久 | 男男gv在线播放网站亚洲 | 2021少妇久久久久久久久久 | 国产无套抽出白浆来 | 天堂网在线观看视频 | 久久婷婷色综合老司机 | 亚洲天堂色网站 | 大陆日韩欧美 | 男人添女人下部高潮全视频 | 伊人情人综合 | 午夜国产在线观看 | 中文字幕视频网 | 久久人人爽亚洲精品天堂 | 国产38页 | 日韩新无码精品毛片 | 国产午夜伦理片 | 日韩内射激情视频在线播放免费 | 欧州一区二区 | 久久久av免费 | 国产人碰人摸人爱免费视频 | 黄色在线观看网址 | 欧美性折磨bdsm激情另类视频 | 国产性做爰xxx| 亚洲综合自拍偷拍 | 亚洲日本乱码中文在线电影 | 亚洲一区二区三区综合 | 丝袜一区二区三区在线播放 | 亚洲日韩av在线观看 | 久久精品国产99久久美女 | 国产成人无码精品一区不卡 | 色综合狠狠操 | 青青久草在线 | 国产精品亚洲视频 | 少妇高潮毛片高清免费播放 | www.午夜精品 | 国产原创av中文在线观看 | 久久久综合九色合综 | youjizz在线视频 | 久久精品免费国产大片 | 精品人妻无码一区二区三区抖音 | 国产免费av在线 | 亚洲中文字幕无码卡通动漫野外 | 国产成人免费一区二区三区 | 免费av一区二区三区天天做 | 欧美黄色性视频 | 国产三级精品三级在线观看 | 亚洲 欧美 综合 在线 精品 | 亚洲午夜无码毛片av久久 | 在线日韩| 国产天天综合 | 蜜臀av无码人妻精品 | 亚洲精品久久av无码麻 | 51国产偷自视频区免费播放 | 成人黄色免费在线观看 | 超级乱淫重口俱乐部 | 国精产品乱码视频一区二区 | 精品第一国产综合精品aⅴ 亚洲免费视频观看 | 深夜av福利 | 99久久99这里只有免费费精品 | 欧美三级欧美成人高清www | 九九久久视频 | 伊人精品成人久久综合全集观看 | 91小视频在线 | 小说区图片区视频区 | 成人免费精品网站 | 日本三线免费视频观看 | 色多多在线视频 | 激情啪啪网 | 91视频h| 成人女人黄网站免费视频 | 成人精品动漫一区二区 | 91精品91久久久中77777 | 日韩人妻无码精品一专区二区三区 | 国产超碰人人做人人爽av动图 | 国产又粗又硬又爽 | 强乱中文字幕 | 日本mv在线视频 | 9re热国产这里只有精品 | 美女国产免费 | 钻石午夜影院 | 色wwwwww| 久久婷婷丁香 | 国产乱淫a∨片免费视频牛牛 | 天天精品 | 日本免费无遮挡毛片的意义 | 午夜视频网站 | 精品亚洲一区二区三区 | 午夜黄色一级片 | 成人精品视频一区二区三区 | 午夜小视频在线免费观看 | 人人爽人人爽人人爽人人片av |